本发明属于微生物，具体涉及一株产香酵母菌株及其筛选方法和在酒类酿造中的应用。
背景技术：
1、产香酵母泛指一类在生长代谢过程中可以生成以酯类为代表性成分或前体物质的酵母菌，又名产酯酵母或生香酵母，起到丰富香气、改善感官品质等作用，具备提升酒体感官品质的潜力。但单一种类的酿酒酵母产酒精能力较强，产酯能力较弱；单一种类的产香酵母产酯能力较强，产酒精能力较弱。因而同时接入酿酒酵母与产香酵母，使二者优势互补，从而可使最终发酵产品风味协调，层次丰富。但现今主流酿酒工艺中仍然主要以单菌株发酵生产啤酒、果酒，通过上述混合酿酒酵母与产香酵母协同发酵的方式进行酒体酿造，可赋予果酒更复杂的口感与香气，在其发酵过程中的产香酵母代谢是果酒中风味物质形成的重要原因，优良的产香酵母不仅可以赋予果酒较为独特的香气，还有利于改善果酒品质。
2、酒类当中具有的独特香气，为酒体中所含各种化合物共同作用的结果，其中，高级醇、酯类、有机酸构成了酒类独有的香气，而产香酵母会在发酵过程中同样会产生各种代谢副产物，如酯类、高级醇与低级脂肪酸，构成了独特的发酵香气，与发酵产品的风味的形成密切相关。因此，筛选驯化性状稳定、产酯能力强的野生型产香酵母并将其应用于酒类发酵（如：果酒发酵与啤酒发酵），将是解决酒体风味单一化的一条重要途径。
技术实现思路
1、蔗糖是生活必须品，是关系大国民生的重要战略物资，传统亚硫酸法制糖为化学澄清工艺，其过程中需要添加各种化学助剂，存在安全隐患，绿色生产已然成为糖业发展的未来。本技术发明人所在团队应用陶瓷膜过滤甘蔗混合汁进行物理方法生产砂糖进行了大量研究，建成了3000 t/d的试验性生产线，其中生产清汁所截留的甘蔗汁浓缩截留液作为主要膜滤过程副产物，日产量较大，暂无非常高效的处理方式，当前所有截留液均会排回亚法制糖生产线的压榨阶段，重复挤压，沉降，随亚法制糖过程继续生产制造为原糖，可见其仍然无法彻底脱离传统亚法制糖生产过程；因此陶瓷膜过滤甘蔗汁浓缩截留液的处理问题成为了困扰膜法制糖推广的一大难点；其中的高糖分导致了浓缩液易于腐败，生产量大难以保存。因此，本技术发明人在对陶瓷膜过滤甘蔗汁截留液的研究中，从新鲜截留液中分离筛选纯化出了11株产香酵母，通过嗅闻技术对其产香能力的筛选鉴定出产香能力较强的ym12菌株，通过菌落观察、镜检、26s rdna区域的sanger测序综合鉴定本株酵母为 kazachstaniaexigua种，而近年来对于 kazachstania属的酵母菌在产香方面的研究仍然少有。gutiérrez等人在葡萄酒、苹果酒、啤酒中分离出 kazachstaniazonata并发现其为产香酵母，产酯能力强；杨建刚等人利用多态性分析技术分析得出 kazachstaniaexigua为泸州老窖浓香型窖糟醅的优势菌株之一。
2、 kazachstania哈萨克斯坦酵母属是在众多传统发酵食品当中自然存在的优势菌种，其产香能力优异，可发酵麦芽糖，但现如今仍然暂无较多将其用于酿酒复配菌种发酵的实例，其不仅在甘蔗汁膜滤浓缩液中以106cfu/ml数量级存活且作为其中绝对优势的酵母菌株，且均由各种浓香型白酒、葡萄酒、苹果酒、啤酒当中检测出，且普遍具备较高的风味物质产量。
3、本发明的目的在于提供一株产香酵母菌株及其筛选方法和在酒类酿造中的应用。该产香酵母菌株是从陶瓷膜过滤甘蔗汁截留液中培养分离筛选纯化得到，产酯能力强、可以产生浓郁花果香风味，可用于制备啤酒/果酒发酵剂。将其与商用酿酒酵母进行复配使用可解决酿酒酵母香型单一的问题，用于酒类酿造，可赋予酒体一种富含花果香且较为新颖独特的味道。
4、本发明采用的技术方案如下：
5、本发明提供了一株产香酵母菌株，该产香酵母菌株为少孢哈萨克斯坦酵母（ kazachstaniaexigua）ym12，其于2024年06月24日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为cgmcc no. 30909。该产香酵母菌株在10℃至40℃环境中可生长，可生长适合ph环境为2.5～8。在ym固体培养基上培养，其菌落形态为乳白色、光滑、不透明、圆形菌落，挑起呈半固体状，嗅闻有浓郁花果清香，平均直径4～8 mm。其菌体形态在光学显微镜100×油镜下呈圆形，有较大液泡，呈透明或灰白色菌体。对该菌株进行26s rdna序列分析。综合菌落特征与分子生物学鉴定，确定该产香酵母菌株为少孢哈萨克斯坦酵母（ kazachstaniaexigua）。
6、进一步的，本发明还提供了上述的产香酵母菌株的筛选方法，该产香酵母菌株从陶瓷膜过滤甘蔗汁截留液中培养分离筛选纯化得到，具体包括如下步骤：
7、（1）取样：取陶瓷膜过滤澄清的甘蔗汁浓缩液，搅拌混匀后取样，装入无菌离心管与无菌采样瓶中，干冰速冻；
8、（2）培养：取浓缩液，通过传统培养方式培养分离，挑取白色偏黄、表面粗糙、形似酵母、嗅闻有明显香气的单菌落进行单克隆平板划线，进一步培养纯化；
9、（3）酵母产香能力筛选：将筛选出的11～13株疑似产香菌株菌悬液接种添加甘蔗汁与浓缩麦芽汁的ym液体培养基中，不接种菌株作为空白对照，28℃、200 rpm摇床培养48～72 h，进行嗅闻实验与总酯含量测定；
10、（4）根据嗅闻实验与各菌株总酯产量测定最终筛选得到一株产酯性能较强、在嗅闻实验中明显较于其他菌株具有更好的清香味并且可以产出果香与花香的产香酵母菌株ym12；通过菌落特征和26s rdna序列分析确定产香酵母菌株ym12为少孢哈萨克斯坦酵母（ kazachstaniaexigua）。
11、进一步的，上述的产香酵母菌株的筛选方法中，步骤（2）具体为：从新鲜浓缩液中取1 ml浓缩液，使用无菌生理盐水稀释105、106、107倍后，各100μl接种于ym固体培养基中，28℃培养48 h，分别挑取白色偏黄、表面粗糙，形似酵母、嗅闻有明显香气的单菌落进行单克隆平板划线，28℃培养36~48 h，菌株纯化3次，待用。
12、上述的产香酵母菌株的筛选方法中，所述的ym液体培养基的制作方法为：酪蛋白胨5 g，麦芽浸粉3 g，葡萄糖10 g，酵母浸粉3 g，加热溶解于1000 ml蒸馏水中，25℃，ph为6.2±0.2，121℃高压灭菌15 min；所述的ym固体培养基的制作方法为：酪蛋白胨5g，麦芽浸粉3g，葡萄糖10g，酵母浸粉3g，琼脂粉20g，加热溶于1000 ml蒸馏水中，25℃，ph=6.2±0.2，121℃高压灭菌15 min。
13、本发明筛选得到的产香酵母菌株ym12可采用斜面保藏（斜面培养基为麦芽汁琼脂斜面培养基）、甘油保藏或冻干保藏的方法进行保藏。
14、另一方面，本发明还提供了所述的产香酵母菌株在酒类酿造中的应用。
15、进一步的，所述的产香酵母菌株ym12在制备啤酒/果酒发酵剂中的应用。
16、实际应用时，可使用膜法澄清甘蔗糖浆与糖化麦汁混合作为啤酒原料，使用膜法澄清甘蔗汁作为果酒原料，以产香酵母菌株ym12和商用酿酒酵母的混合菌剂作为啤酒/果酒发酵剂，进而生产出具有独特花果香风味的甘蔗啤酒与甘蔗果酒。由该方法混菌发酵生产出的甘蔗啤酒/甘蔗果酒相比单菌发酵生产的甘蔗啤酒/甘蔗果酒香气成分产生显著变化。采用该方法不仅可以进一步利用膜法制糖工艺中产出的膜法澄清甘蔗糖浆、澄清甘蔗汁为原料进行制酒，而且制得的甘蔗啤酒和甘蔗果酒香气浓郁、花果香型风味显著、香型协调，具有独特香气与风味。
17、而且膜法制糖是一种新型的甘蔗制糖技术，利用分离膜精确的物理筛分作用，实现甘蔗混合汁的除杂、澄清、脱色和浓缩，得到甘蔗清汁用于制糖全过程中无需使用化学工艺进行处理，无需使用硫熏工艺进行处理。本发明使用膜法制糖工艺中产生的甘蔗清汁作原料，可以避免成品酒中出现不好的硫熏味，更大程度上实现产品清爽的啤酒风味。
18、本发明还提供了一种啤酒/果酒发酵剂，所述啤酒/果酒发酵剂中包含有上述的产香酵母菌株。
19、进一步的，所述啤酒/果酒发酵剂中还包含商用酿酒酵母。优选的，所述的啤酒/果酒发酵剂，以产香酵母菌株ym12与商用酿酒酵母bf16的混合菌种作为啤酒/果酒发酵剂。
20、陶瓷膜过滤甘蔗汁浓缩截留液（即：在膜法制糖过程中产生的膜滤过程副产物，包含甘蔗混合汁中影响清汁澄清度的各种杂质与糖分）较好的保留了甘蔗原有的清香与甘蔗本身所携带的菌株，本发明从新鲜甘蔗汁截留液中筛选出野生型优质产香酵母，并利用于广西特色甘蔗果酒、甘蔗啤酒当中，为甘蔗酒品带来更加多元化的香气成分，研究产香酵母ym12的生物学特性，对啤酒、果酒乃至白酒的混菌酿造具有重要意义。
21、本发明的有益效果为：
22、1、本发明通过传统培养方式从陶瓷膜过滤甘蔗汁截留液中培养分离筛选纯化出一株可以产生浓郁花果香风味的产香酵母菌株ym12，该产香酵母菌株ym12产酯能力强、可以产生浓郁花果香风味，香气令人愉悦，可作为产香酵母应用于啤酒酿造或果酒酿造中，用于制备啤酒/果酒发酵剂。将其与商用酿酒酵母进行复配使用可解决酿酒酵母香型单一的问题，用于酒类酿造，可赋予酒体一种富含花果香且较为新颖独特的味道。而且该菌株生产耐受性能较好，从10℃～40℃环境中可生长，可生长适合ph环境为2.5～8。本发明提供的产香酵母菌株ym12可适用于各类啤酒与果酒的酿造。
23、2、将本发明提供的产香酵母菌株ym12应用于甘蔗啤酒酿造与甘蔗果酒酿造，相比于单菌株发酵的传统酿酒酵母，产香酵母ym12与传统酿酒酵母混菌发酵的方式为甘蔗啤酒与甘蔗果酒皆提供了更为显著的花果香型风味，香型协调，酒体风味均衡。
24、3、本发明采用产香酵母菌株ym12（ kazachstaniaexigua）与商用酿酒酵母bf16（ saccharomyces cerevisiae）混合菌种作为甘蔗啤酒、甘蔗果酒发酵剂，两种菌株在发酵过程中未明显产生拮抗作用，生产出的甘蔗啤酒、甘蔗果酒香气浓郁，酒香、清香味、果香味、花香味均较为均衡，酒体清澈，入口醇厚回甘，相较于单酵母发酵的甘蔗啤酒、甘蔗果酒具有独特香气与风味。
25、生物保藏说明：
26、本发明提供的产香酵母菌株于2024年06月24日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no. 30909，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；分类命名： kazachstaniaexigua。
1.一株产香酵母菌株，其特征在于，该产香酵母菌株为少孢哈萨克斯坦酵母（kazachstaniaexigua）ym12，保藏编号为cgmcc no. 30909。
2.权利要求1所述的产香酵母菌株的筛选方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的产香酵母菌株的筛选方法，其特征在于，所述的步骤（2）具体为：从新鲜浓缩液中取1 ml浓缩液，使用无菌生理盐水稀释105、106、107倍后，各100μl接种于ym固体培养基中，28℃培养48 h，分别挑取白色偏黄、表面粗糙、形似酵母、嗅闻有明显香气的单菌落进行单克隆平板划线，28℃培养36～48 h，菌株纯化3次，待用。
4.根据权利要求3所述的产香酵母菌株的筛选方法，其特征在于，所述的ym液体培养基的制作方法为：酪蛋白胨5 g，麦芽浸粉3 g，葡萄糖10 g，酵母浸粉3 g，加热溶解于1000 ml蒸馏水中，25℃，ph为6.2±0.2，121℃高压灭菌15 min；所述的ym固体培养基的制作方法为：酪蛋白胨5g，麦芽浸粉3g，葡萄糖10g，酵母浸粉3g，琼脂粉20g，加热溶于1000 ml蒸馏水中，25℃，ph=6.2±0.2，121℃高压灭菌15 min。
5.如权利要求1或2所述的产香酵母菌株在酒类酿造中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的产香酵母菌株ym12在制备啤酒/果酒发酵剂中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，使用膜法澄清甘蔗糖浆与糖化麦汁混合作为啤酒原料，使用膜法澄清甘蔗汁作为果酒原料，以产香酵母菌株ym12和商用酿酒酵母的混合菌剂作为啤酒/果酒发酵剂，进行生产出具有独特花果香风味的甘蔗啤酒与甘蔗果酒。
8.一种啤酒/果酒发酵剂，其特征在于，所述啤酒/果酒发酵剂中包含权利要求1或2所述的产香酵母菌株。
9.根据权利要求8所述的啤酒/果酒发酵剂，其特征在于，所述啤酒/果酒发酵剂中还包含商用酿酒酵母。
10.根据权利要求9所述的啤酒/果酒发酵剂，其特征在于，以产香酵母菌株ym12与商用酿酒酵母bf16的混合菌种作为啤酒/果酒发酵剂。
