本发明属于预防兽医领域，涉及一种非洲猪瘟与古典猪瘟重组二联活疫苗及其制备方法与应用，特别涉及表达古典猪瘟病毒e2蛋白的重组非洲猪瘟病毒弱毒株，本发明还涉及所述重组非洲猪瘟病毒株的构建方法及其在制备防控非洲猪瘟病毒及古典猪瘟病毒感染的重组二联活疫苗中的应用。
背景技术：
1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)感染引起的急性、高致死性疾病。世界动物卫生组织(woah)将其列为法定需要报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染性疾病。
2、asfv为非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是唯一虫媒dna病毒。asfv的宿主包括家猪、非洲疣猪、丛林猪以及软蜱。asfv感染猪表现为高热、心率加快、呼吸困难、皮肤发绀、脾及淋巴结等免疫器官水肿出血。不同毒力的毒株感染会导致不同的临床表现，感染后通常在3～10d内死亡，家猪死亡率接近100％。asfv在软蜱体内可以形成持续性感染而不表现出明显的临床症状。asfv基因组全长为170～193kb，含有150～167个开放阅读框(open reading frames，orfs)，编码150～200个蛋白质，其中结构蛋白50多个，非结构蛋白100多个，asfv基因编码的蛋白质一半以上属于未知功能的蛋白质。
3、2018年8月，我国首次报道并分离到asfv，全基因组序列分析表明为基因ii，致病力试验显示为强毒株，接种猪呈急需发病，100％死亡。迫切需要开展asf疫苗研究。目前，国内研究人员以非洲猪瘟病毒分离株pig/hlj/2018为骨架，遴选出一株7基因缺失株rasfvhlj/18-7gd(简称hlj/18-7gd)，可有效保护非洲猪瘟病毒强毒的致死性攻击，是理想的疫苗候选株。
4、古典猪瘟(classical swine fever)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus,csfv)引起的传染性强，高致病性疾病，目前遍布于全球。猪瘟病毒属于黄病毒科瘟病毒属的成员，其基因组为单股正链rna病毒。csfv由c、e0、e1和e2四种结构蛋白组成。其中，e2蛋白是csfv病毒结构蛋白中惟一能够诱导机体产生中和抗体的保护性抗原。
5、减毒活疫苗和亚单位疫苗相结合被视为有效的基因工程疫苗，在不需要佐剂的条件下单次注射就可以诱导持久有效的免疫保护作用。目前，痘病毒、杆状病毒、腺病毒和伪狂犬病毒等常被作为减毒活疫苗的病毒载体。腺病毒、伪狂犬病毒和痘病毒等作为活载体已经用于csfv疫苗研究。但未见asfv作为载体表达csfv相关蛋白进行疫苗开发的报道。因此开发表达csfv e2蛋白重组非洲猪瘟疫苗株的构建具有开创性意义，可用于同时预防asfv和csfv这两种危害极大的烈性传染病，具有巨大的经济和社会效益。
技术实现思路
1、为了改进现有技术中的不足，本发明第一方面提供了一种基因工程病毒毒株，所述基因工程病毒毒株以非洲猪瘟病毒载体毒株为基因工程载体，所述基因工程病毒毒株的基因组中具有能够表达的古典猪瘟病毒e2蛋白基因。
2、根据本发明实施例可以毫无疑义地确信，将古典猪瘟病毒e2蛋白基因转入不同的非洲猪瘟病毒毒株形成的基因工程重组病毒毒株，接种猪，均能够产生针对古典猪瘟病毒e2蛋白的中和抗体。针对猪瘟病毒的感染具有免疫力，也能够产生与非洲猪瘟病毒毒株接近的针对非洲猪瘟病毒的抗体，针对非洲猪瘟病毒的感染具有免疫力。重组病毒可以用作针对非洲猪瘟病毒与古典猪瘟病毒的二联疫苗的免疫原。本发明证明了古典猪瘟病毒e2蛋白与非洲猪瘟病毒所有蛋白等免疫原的混合物没有可见不良相互作用，可以综合起到激发猪免疫力的作用，协同预防猪的这两种疾病。
3、在一些实施方式中，所述古典猪瘟病毒e2蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
4、在一些实施方式中，所述古典猪瘟病毒e2蛋白的核酸编码序列如seq id no.2所示。
5、在一些实施方式中，所述古典猪瘟病毒e2蛋白基因的启动子为非洲猪瘟病毒p72启动子。
6、在一些实施方式中，所述非洲猪瘟病毒载体毒株为基因ii型非洲猪瘟病毒毒株。
7、在一些实施方式中，所述非洲猪瘟病毒载体毒株为非洲猪瘟病毒弱毒株。
8、在一些实施方式中，在所述非洲猪瘟病毒载体毒株的基因组中，mgf_505-1r基因、mgf_505-2r基因、mgf_505-3r基因、mgf_360-12l基因、mgf_360-13l基因、mgf_360-14l基因和ep402r基因中任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种或七种为失活的基因。
9、在一些实施方式中，所述mgf_505-1r基因的编码序列如非洲猪瘟病毒pig/hlj/2018株基因组27747-29342位的序列所示；
10、所述mgf_505-2r基因的编码序列如非洲猪瘟病毒pig/hlj/2018株基因组33133-34713位的序列所示；
11、所述mgf_505-3r基因的编码序列如非洲猪瘟病毒pig/hlj/2018株基因组34800-35642位的序列所示；
12、所述mgf_360-12l基因的编码序列如非洲猪瘟病毒pig/hlj/2018株基因组29395-30447位的序列所示；
13、所述mgf_360-13l基因的编码序列如非洲猪瘟病毒pig/hlj/2018株基因组30608-31669位的序列所示；
14、所述mgf_360-14l基因的编码序列如非洲猪瘟病毒pig/hlj/2018株基因组31854-32927位的序列所示；
15、所述ep402r基因的编码序列如非洲猪瘟病毒pig/hlj/2018株基因组73394-74476位的序列所示；
16、所述pig/hlj/2018株的genbank序列号为mk333180.1。
17、在一些实施方式中，所述失活的基因片段为缺失突变、插入突变或替换突变。
18、在一些实施方式中，所述非洲猪瘟病毒载体毒株的微生物保藏号为：cctcc no:v201924。
19、在一些实施方式中，所述非洲猪瘟病毒载体毒株是通过基因工程改造微生物保藏号为cctcc no:v202403的非洲猪瘟病毒得到的。
20、本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的基因工程病毒毒株的制备方法，所述制备方法为将古典猪瘟病毒e2蛋白基因转入所述非洲猪瘟病毒载体毒株，得到所述基因工程病毒毒株。
21、在一些实施方式中，通过同源重组方法，将所述古典猪瘟病毒e2蛋白基因转入所述非洲猪瘟病毒载体毒株。
22、本发明第三方面提供了一种基因工程疫苗组合物，所述基因工程疫苗组合物以本发明第一方面所述的基因工程病毒毒株或通过本发明第二方面所述的制备方法制备得到的基因工程病毒毒株为唯一免疫原，多价疫苗中的一种免疫原，或多联疫苗中的一种免疫原。
23、在一些实施方式中，所述基因工程疫苗组合物为活病毒疫苗组合物。
24、在一些实施方式中，所述基因工程疫苗组合物还包括辅料。
25、本发明第四方面提供了本发明第一方面所述的基因工程病毒毒株，或本发明第三方面所述的基因工程疫苗组合物，在制备用于单独使用，用于与其他免疫制剂和/或药物联合使用，或用作与其他免疫制剂和/或药物组成的复方制剂的组分以预防、减缓和/或控制非洲猪瘟和/或古典猪瘟的制剂中的用途。
26、本发明相对于现有技术的优点在于：以基因缺失的重组病毒hlj/18-7gd为载体，表达具有免疫原性的猪瘟病毒e2蛋白，制备了将非洲猪瘟病毒减毒活疫苗和古典猪瘟亚单位疫苗相结合的基因工程疫苗毒株rasfv-hlj/18-7gd-e2(简称hlj/18-7gd-e2)，能够表达e2蛋白且具有较好的免疫原性，同时产生针对非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒的抗体，针对非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒强毒的攻击可以完全保护。本发明证实hlj/18-7gd能够作为一种安全有效的活病毒载体来构建多联疫苗，而且重组病毒hlj/18-7gd-e2可作为预防和控制非洲猪瘟-猪瘟重组二联活疫苗。本发明支持一种新的基因工程疫苗载体模型，可用于将其他猪病原体的主要免疫原转入基因缺失的重组病毒hlj/18-7gd，同时预防非洲猪瘟与其他猪病，亦可用于转入多种病原体抗原，制备多联疫苗。
1.一种基因工程病毒毒株，所述基因工程病毒毒株以非洲猪瘟病毒载体毒株为基因工程载体，所述基因工程病毒毒株的基因组中具有能够表达的古典猪瘟病毒e2蛋白基因。
2.如权利要求1所述的基因工程病毒毒株，其特征在于，选自如下c1、c2、c3、c4、c5中任一种或其组合：
3.如权利要求1或2所述的基因工程病毒毒株，其特征在于，在所述非洲猪瘟病毒载体毒株的基因组中，mgf_505-1r基因、mgf_505-2r基因、mgf_505-3r基因、mgf_360-12l基因、mgf_360-13l基因、mgf_360-14l基因和ep402r基因中任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种或七种为失活的基因。
4.如权利要求1-3中任一项所述的基因工程病毒毒株，其特征在于，所述mgf_505-1r基因的编码序列如非洲猪瘟病毒pig/hlj/2018株基因组27747-29342位的序列所示；
5.如权利要求1-4中任一项所述的基因工程病毒毒株，其特征在于，选自如下d1、d2、d3中任一种或其组合：
6.权利要求1-5中任一项所述的基因工程病毒毒株的制备方法，所述制备方法为将古典猪瘟病毒e2蛋白基因转入所述非洲猪瘟病毒载体毒株，得到所述基因工程病毒毒株。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，通过同源重组方法，将所述古典猪瘟病毒e2蛋白基因转入所述非洲猪瘟病毒载体毒株。
8.一种基因工程疫苗组合物，所述基因工程疫苗组合物以权利要求1-5中任一项所述的基因工程病毒毒株或通过权利要求6或7所述的制备方法制备得到的基因工程病毒毒株为唯一免疫原，多价疫苗中的一种免疫原，或多联疫苗中的一种免疫原。
9.如权利要求8所述的基因工程疫苗组合物，其特征在于，所述基因工程疫苗组合物为活病毒疫苗组合物；
10.权利要求1-5中任一项所述的基因工程病毒毒株，或8或9所述的基因工程疫苗组合物，在制备用于单独使用，用于与其他免疫制剂和/或药物联合使用，或用作与其他免疫制剂和/或药物组成的复方制剂的组分以预防、减缓和/或控制非洲猪瘟和/或古典猪瘟的制剂中的用途。
