本发明涉及荧光微球，具体涉及一种核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法。
背景技术：
1、荧光微球受到外界能量刺激可以激发出荧光，这种特性使其在生物、医学、检测成像和防伪检测等领域有着深远的应用，其中，应用于药物防伪的需求越来越大，在药品内部或片剂表面对药品本身进行标记，将是打击假药的一大进步。由于涉及到吞服和体内使用，因此对于此类应用的荧光微球要求具有可食用性。一般来说，常用的可食用微球基体材料包括聚合物、脂质、天然高分子等生物材料。丝素蛋白(sf)具有生物相容性好，免疫原性低，目前已被批准用于广泛的食品应用，并得到了美国食品和药物管理局(fda)认证。部分有机荧光染料已被证明对人体是安全的，常在药物和医疗中使用，包括荧光素及其衍生物、花青类染料等。因此，认为以sf为基体，以可食用荧光染料为荧光来源，是制备可食用丝蛋白荧光微球的良好选择。
2、微流控技术以其微型化、集成化、高通量、高灵敏度、易于操作等优点，在生物、医药、环境、化工等领域具有广泛的应用前景。目前，微流控方法已经流行于生成单相或多相液滴，例如w/o/w(水/油/水)，o/o/w(油/油/水)和o/w/o(油/水/油)型液滴。但是，对于丝蛋白荧光微球，其基体丝素蛋白是水溶性的，荧光来源可食用荧光染料也是水溶性的，因此，可食用丝蛋白荧光微球为w/w/o(水/水/油)型核壳结构。针对w/w/o型核壳结构的微球，微流控技术的制备仍鲜有报道，这是因为w/w双水相系统往往形成均质结构，而不是核壳结构，而核壳结构更有利于荧光的长久性，因此制备核壳结构的丝蛋白荧光微球具有必要性。
3、专利cn116850907a公开了一种以双水相乳液为模板制备核壳结构的单分散水凝胶微球的方法与应用，提出了一种以可食用疏水蛋白纳米颗粒为主要壁材、亲水蛋白为芯材的水凝胶微球的制备方法，将可食用疏水蛋白和阴离子多糖溶液在一定ph条件下混合，并通过真空浓缩获得疏水蛋白纳米颗粒；将亲水蛋白溶液和中性多糖溶液混合并加热，经冷却后，添加疏水蛋白纳米颗粒和二价阳离子溶液，经水洗后获得可食用的具有良好单分散性和亲水-疏水核壳结构的水凝胶微球，具有食用安全性高、绿色无污染、生产成本低、产量大等优点。但该方法制备得到的微球核壳结构不够明显，微球的大小均匀度和制备过程的便捷性不如微流控技术。
4、专利cn115573167a公开了一种水性荧光微球、水性荧光微球纺织品及其制备方法及应用，提出了一种水性荧光微球的制备方法及应用，以羧基化聚苯乙烯微球为载体，通过离子交换吸附法将荧光物质吸附在微球上，获得了在水溶液中具有很好的分散性，并且在普通日光灯照射下溶液为无色，而在紫外灯照射下显示明亮的荧光色的荧光微球，通过与水性胶黏剂复配，可以将荧光微球负载在纺织品上，使其具有良好的防伪效果及加密效果。虽然聚苯乙烯一般认为是无毒的，但制备过程中涉及到丙酮、二氯甲烷等有毒溶剂的使用，因此将其作为可食用荧光微球有一定的局限性。
5、专利cn108653741a公开了一种金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶蛋白微球及其制备方法和应用，提出了一种丝胶蛋白微球的制备方法与应用，通过将丝胶蛋白溶液加入玉米油中得到丝胶蛋白微球；将微球与药物共孵育，并在中性或弱碱性条件下加入酚类物质和金属离子，最终得到金属有机配位聚合物包裹的载药丝胶蛋白微球。该发明制备的丝胶蛋白微球结构稳定、粒径均一、在水中分散良好，保留了丝胶蛋白本身的荧光特性。但丝胶蛋白这种天然材料具有荧光强度较低、荧光耐久性较差等局限性，且与丝素蛋白相比，由于含有一些致敏成分，丝胶蛋白容易引起部分人群的免疫反应，因此其在生物医学领域的应用受到限制。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是提供一种核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，采用三相同轴微流控装置，以水溶性荧光染料为内相、以水溶性丝素蛋白溶液为中相、以油相为外液相，通过在外液相中添加醇类溶剂诱导sf的二级结构向不溶于水的β-折叠结构转变对sf进行固化形成壳层，同时，通过控制微流控装置中内相和中相的混合尺度，使内相荧光染料包裹于中相固化的sf内而不混溶，以形成核壳结构的丝蛋白荧光微球。
2、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，包括如下步骤：
3、s1、将可食用荧光染料溶于水作为内相，将丝素蛋白溶于水作为中相，将油类和表面活性剂溶于醇类溶剂作为外相，将醇类与水混合作为收集液；
4、s2、将所述内相、中相和外相分别泵入微流控芯片内同轴设置的第一毛细管、第二毛细管和第三毛细管；
5、所述第一毛细管的出液端伸入第二毛细管的进液端，所述第二毛细管的出液端伸入第三毛细管的进液端，所述第三毛细管的出液端通入所述收集液中；
6、s3、所述内相经第一毛细管进入第二毛细管并与所述第二毛细管内的中相以层流的方式进入第三毛细管中的外相，在剪切力的作用下微球成型，并通过外相中的醇类溶剂诱导中相中的丝素蛋白结构转变固化，微球进入收集液进一步固化得到所述核壳结构可食用丝蛋白荧光微球。
7、本发明以水溶性荧光染料为内相，以水溶性丝素蛋白为中相，以油类溶液为外相，通过同轴设置的三相微流控芯片制备微球，微流控芯片中，内相和中相接触后在一定距离内不混溶，以层流的方式进入第三毛细管的外相，原理为：
8、微流控芯片中微流体的直径小于1mm，在这样的微尺度下，与宏观流体的惯性力占主导不同，微流体的粘滞力会超越惯性力占主导地位，表现出层流的特征，即不同支道的两种流体在进入主流道后一定距离内并不会如宏观流体中很快混合，而是以层流的方式继续前进。从理论上解释，雷诺数re＝惯性力/粘滞力＝ρdv/μ(v为流体的流速，ρ为流体的密度，μ为流体的黏性系数，d为管道的直径)，所以对于微流体，直径很小，re会很小，导致流体的粘性作用非常明显。
9、内相和中相以层流的方式进入外相后，在剪切力的作用下形成w/w/o型微球，外相中添加表面活性剂，抑制微球的团聚，同时外相中的醇类溶剂诱导sf的二级结构转变为不溶于水的β-折叠结构固化形成初步壳体，微球进入收集液后通过收集液中的醇类继续sf的固化，形成稳定的核壳结构的丝蛋白荧光微球。
10、进一步的，所述微球进入收集液后静置15-20min，吸走收集液中的上清液后，继续静置12h以上至sf完全结晶固化，过滤微球并通过乙醇清洗微球表面残留油类后常温晾干。
11、进一步的，所述外相中的醇类溶剂和收集液中的醇类相互独立的选自甲醇和/或乙醇，优选为乙醇，所述外相中醇类溶剂的质量百分比为10％-30％，所述收集液中醇类的质量百分比为30％-70％。
12、进一步的，所述中相中丝素蛋白的质量浓度为5％-9％。
13、进一步的，所述中相中油类为油酸、甘油、棕榈酸异丙酯中的一种或几种。
14、进一步的，所述中相中表面活性剂为司盘80和/或硬脂酰乳酰乳酸钠。
15、进一步的，所述中相中表面活性剂的添加量为油类和醇类溶剂总质量的0.5％-2％。
16、进一步的，所述内相中荧光染料为香豆素及其衍生物、荧光素钠、亚甲基蓝、吲哚菁绿中的一种或几种。
17、进一步的，所述内相中荧光染料的质量浓度为0.05％-2％。
18、进一步的，所述第一毛细管、第二毛细管和第三毛细管的内径为0.4-0.8mm，壁厚为0.01-0.05mm，所述第一毛细管出液端面与第二毛细管出液端面的距离为5-20mm。控制毛细管的内径尺寸及内相和中相层流的距离(即第一毛细管出液端面与第二毛细管出液端面的距离)确保内相和中相不混溶，距离数据根据内相和中相的进样速率调控，速率越慢、距离越长。
19、进一步的，所述第一毛细管和第二毛细管的出液端经程控垂直拉制仪和锻针仪拉制成尖端，所述第一毛细管尖端的内径为40-120μm，所述第二毛细管尖端的内径为第一毛细管尖端内径的2-5倍。在第一毛细管和第二毛细管的尾部设置尖端便于插入后续的毛细管，且通过尖端与后续毛细管之间设置孔隙为中相和外相的流入提供通道。
20、进一步的，所述微流控芯片还包括中相进样组件和外相进样组件，所述中相进样组件和外相进样组件分别与第二毛细管和第三毛细管的进液端连通。
21、进一步的，所述中相进样组件包括第一方形玻璃毛细管和第一进样针，所述第一毛细管与第二毛细管的连接处穿设于第一方形玻璃毛细管的中相通道，所述第一进样针与第二毛细管均与中相通道连通用于中相进样，且中相通道的两端密封设置防止中相泄漏。
22、进一步的，所述外相进样组件包括第二方形玻璃毛细管和第二进样针，所述第二毛细管与第三毛细管的连接处穿设于第二方形玻璃毛细管的中相通道，所述第二进样针与第三毛细管均与外相通道连通用于外相进样，且外相通道的两端密封设置防止外相泄漏。
23、进一步的，所述内相的流速为20-40μl/min，中相的流速为40-100μl/min，外相的流速为2-8ml/min。
24、本发明的有益效果：
25、本发明通过三相微流控技术制备w/w/o型核壳结构的可食用丝蛋白荧光微球，核层和壳层成分安全，且制备过程中的溶液为水或低毒性、易挥发的醇类，安全性高；核壳结构的丝蛋白荧光微球有助于提高荧光的长久性，同时保障了微球后续加工过程中荧光的稳定性；微流控技术制备荧光微球过程便捷、效率高、原料用料少、可重复性强、微球均匀度高，且通过控制流速和毛细管内径等参数可在20-100μm范围调控微球的粒径。
1.一种核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，其特征在于，所述外相中的醇类溶剂和收集液中的醇类相互独立的选自甲醇和/或乙醇，所述外相中醇类溶剂的质量百分比为10％-30％，所述收集液中醇类的质量百分比为30％-70％。
3.如权利要求1所述的核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，其特征在于，所述中相中丝素蛋白的质量浓度为5％-9％。
4.如权利要求1所述的核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，其特征在于，所述中相中油类为油酸、甘油、棕榈酸异丙酯中的一种或几种。
5.如权利要求1所述的核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，其特征在于，所述中相中表面活性剂为司盘80和/或硬脂酰乳酰乳酸钠。
6.如权利要求1所述的核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，其特征在于，所述内相中荧光染料为香豆素及其衍生物、荧光素钠、亚甲基蓝、吲哚菁绿中的一种或几种。
7.如权利要求1所述的核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，其特征在于，所述第一毛细管、第二毛细管和第三毛细管的内径为0.4-0.8mm，所述第一毛细管出液端面与第二毛细管出液端面的距离为5-20mm。
8.如权利要求7所述的核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，其特征在于，所述第一毛细管和第二毛细管的出液端经程控垂直拉制仪和锻针仪拉制成尖端，所述第一毛细管尖端的内径为40-120μm，所述第二毛细管尖端的内径为第一毛细管尖端内径的2-5倍。
9.如权利要求8所述的核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，其特征在于，所述微流控芯片还包括中相进样组件和外相进样组件，所述中相进样组件和外相进样组件分别与第二毛细管和第三毛细管的进液端连通。
10.如权利要求7所述的核壳结构可食用丝蛋白荧光微球的制备方法，其特征在于，所述内相的流速为20-40μl/min，中相的流速为40-100μl/min，外相的流速为2-8ml/min。
