本发明涉及分析检测，更具体地说，涉及一种聚乙烯醇栓塞微球的制备方法及亚慢性毒性试验方法。
背景技术：
1、微创介入治疗法在医疗技术领域，特别是在如肝癌、肾癌和子宫肌瘤等富含血管的癌症肿瘤治疗方面正得到越来越广泛的应用，而且已经成为治疗无法进行手术切除的肿瘤的首选替代方案。其原理是借助高清晰度的医学影像仪，引导导管经过动脉到达人体内的肿瘤部位，再通过导管灌注抗肿瘤药物的栓塞微球达到阻断肿瘤组织的供血，从而使肿瘤在短时间内萎缩、坏死的治疗目的。
2、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，pva)是一种水溶性高分子材料，具有良好的生物相容性和生物降解性。由于这些优点，pva被广泛应用于医学领域，尤其是作为栓塞材料。栓塞技术在肿瘤治疗中发挥重要作用，通过阻断肿瘤的血液供应，从而导致肿瘤组织缺氧坏死，实现治疗目的。
3、近年来，微创介入治疗技术的进步，使得栓塞治疗成为肿瘤治疗的重要手段之一。聚乙烯醇栓塞微球(pva embolic microspheres)是一种新型的栓塞材料，它们不仅可以有效阻塞血管，还能在特定条件下释放药物，从而增强治疗效果。然而，由于pva材料本身以及制造过程中可能涉及的化学试剂，临床应用前对其毒性进行全面检测非常重要。
4、药物洗脱栓塞微球化疗栓塞术作为新型栓塞技术正在兴起，不仅能够负载化疗药，又能起到栓塞作用，从而实现对肿瘤的持续治疗，提升治疗效果。聚乙烯醇栓塞微球是以聚乙烯醇(pva)为主要栓塞材料的微球，在临床上一般用于长期性栓塞治疗。但其制备过程中需要使用毒性比较大的交联剂，因此在临床使用前进行毒性检测有着非常重要的意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种聚乙烯醇栓塞微球的制备方法及亚慢性毒性试验方法，解决了现有技术中聚乙烯醇栓塞微球制备过程产生的毒性及需要检测的问题。
2、本发明解决技术问题所采用的技术方案是：本发明一方提供一种聚乙烯醇栓塞微球的制备方法，包括如下步骤：
3、s1、制备pva溶液；
4、s2、将pva溶液与戊二醛混合进行交联反应；
5、s3、将交联后的pva溶液在搅拌条件下缓慢加入含有乳化剂的油相溶剂中，持续搅拌进行预乳化，形成粗乳液，对所述粗乳液进行超声乳化；
6、s4、将乳化后的乳液室温下静置搅拌10～60min以初步硬化形成微球结构；之后将乳液置于水浴中继续搅拌，以1℃/min的逐渐升温至37±1℃恒温水浴，在恒温水浴中保持搅拌1～2小时；再逐渐降温至室温，之后置于4±1℃恒温水浴，冷却2～4小时，得微球乳液；将硬化后的微球乳液进行离心分离，离心后弃去上清液，收集沉淀的微球。
7、在本发明的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法中，在s2和s3之间，还包括加入壳聚糖作为交联剂进行交联，壳聚糖在ph4～6的酸性条件下与pva溶液反应，所述壳聚糖的用量是壳聚糖的质量占pva质量的5％～10％。
8、在本发明的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法中，在s3与s4之间还包括：将超声乳化后的乳液加入含乳化剂的外水相，进行二次乳化，形成双层乳液。
9、在本发明的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法中，s1步骤具体包括：称量所需pva粉末，并将去离子水缓慢加热至80℃～90℃，将pva粉末溶于去离子水中进行搅拌，直至pva溶解；其中制备的pva溶液的浓度要求为5％～10％w/v，所述pva粉末的分子量为88000～98000。
10、在本发明的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法中，s2步骤具体包括：
11、s21、使用磷酸盐缓冲液将pva溶液的ph值调节至7.4，将戊二醛溶液用去离子水稀释至浓度0.5％～2％w/v；
12、s22、缓慢加热pva溶液并控制在35℃～45℃，在搅拌和加热条件下，逐滴加入稀释后的戊二醛溶液，加入速率控制在1～2滴/min；
13、s23、保持搅拌和加热条件下，反应时间1～2小时，反应过程中检测溶液的粘度和透明度；
14、s24、反应完成后加入ph7.4的缓冲液，加入量为稀释后的戊二醛溶液体积的2～3倍。
15、在本发明的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法中，s3步骤具体包括：
16、s31、在容器中加入油相溶剂和乳化剂作为油相，所述油相体积为交联后的pva溶液体积的2～3倍，所述乳化剂的浓度为油相体积的0.5％～2％w/v；
17、s32、在搅拌条件下，缓慢加入交联后的pva溶液至油相中，持续搅拌5～10分钟，使交联后的pva溶液初步分散形成粗乳液；
18、s33、将粗乳液进行超声乳化，超声乳化条件为：超声功率200～400w，乳化时间5～15分钟，控制粗乳液温度为20～30℃，且间歇工作模式。
19、在本发明的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法中，s4步骤具体包括：
20、s41、将乳化后的乳液静置在室温20～25℃条件下20～40min，以初步形成微球结构；
21、s42、将初步形成微球结构的乳液置于恒温水浴中，设定温度为37±1℃，保持搅拌速度为300～500rpm；
22、s43、逐步升温至37±1℃，控制升温速率为每分钟1℃；
23、s44、在37±1℃条件下保持乳液硬化1～2小时；
24、s45、再逐步降温至室温；
25、s46、将降置室温的微球乳液置于冷却水浴中继续硬化，温度控制在4±1℃，冷却时间为2～4小时；
26、在本发明的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法中，在步骤s4之后还包括s5洗涤和干燥，具体包括：
27、s501、洗涤：将分离后的微球置于去离子水中，轻轻搅拌，使残留的交联剂和油相溶解于水中，通过离心法分离微球，弃去上清液；重复以上步骤至少3次，确保微球表面和内部的残留物被彻底去除；离心条件为3000～5000rpm，离心时间5～10分钟，离心后弃去上清液，收集沉淀的微球；
28、s502、中性ph值调整：在最后一次洗涤时，使用ph 7的去离子水，确保微球处于中性环境中；
29、s503、预冻处理：将洗涤后的微球分散在冷冻保护剂溶液中，均匀分布在冷冻干燥托盘上；将托盘置于-18～-22℃的冷冻箱中预冻1～3小时，确保微球中的水分结冰；
30、s504、冷冻干燥：将预冻后的微球转移至冷冻干燥机中，启动冷冻干燥过程，冷冻干燥条件为：真空度：0.1mbar，温度：-40℃，时间：48小时。
31、s505、后处理：干燥结束后，取出干燥的微球，迅速转移至干燥箱中，温度控制在20～30℃，相对湿度控制在20％以下。
32、在本发明的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法中，在s4过程中，在硬化过程中还加入化学硬化剂钙离子溶液。
33、本发明第二方面还提供了聚乙烯醇栓塞微球的亚慢性毒性试验方法，基于上述制备方法制备的聚乙烯醇栓塞微球，亚慢性毒性试验方法包括：
34、采用0.9％氯化钠溶液(sc)作为浸提介质，按0.2g/ml的浸提比例，于37℃条件下浸提72小时制备试验样品浸提液，空白浸提液为0.9％氯化钠溶液(sc)同条件下制备；
35、将40只实验动物被分为2组，包括试验组和对照组，每组试验动物雌雄各半；
36、将试验样品浸提液注射到一组20只动物体内，将空白浸提液注射到对照组20只动物体内，注射途径为静脉注射，每天注射一次，连续注射28天；
37、分别在检测开始及检测结束时对实验动物进行称重；饲养期间，每周测量并报告试验动物饮食摄入量；
38、饲养期间每天观察评价临床症状以及毒性反应；
39、检测结束时，对所有的实验动物进行大体病理学检查、血液学检测以及血液生化检测；以及进行组织病理学检查并称量内脏湿重。
40、在本发明的亚慢性毒性试验方法中，将40只试验动物分成2组，包括极性试验样品组以及极性对照组，极性试验样品组以及极性对照组分别包含10只雄性和10只雌性；
41、饲养期间每天观察评价临床症状以及毒性反应包括呼吸、肌肉运动、痉挛、反射、眼症状、心血管症状、流涎、立毛、痛觉丧失、肌肉状态、胃肠和皮肤；
42、所述血液学检测包括凝血(pt、aptt)、血红蛋白浓度、红细胞压积、血小板计数、红细胞计数、白细胞计数和白细胞分类方面的检查；
43、所述血液生化检测包括白蛋白、碱性磷酸酶(alp)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶、钙、氯化物、胆固醇、肌酐、谷氨酰转肽酶(ggt)、葡萄糖、无机磷、钾、钠、总胆红素、总蛋白、甘油三酯和尿素氮方面的检查；
44、大体病理学检查包括检查体表、孔口、头部、胸腔腹腔及内脏，记录肾上腺、脑、附睾、心、肾、卵巢、脾、肝、睾丸、胸腺和子宫的重量；
45、所述组织病理学检查包括心脏、肝脏、肾上腺、肾脏、皮肤、脾脏、肌肉、大脑、睾丸、卵巢、肺、支气管和股骨。
46、实施本发明的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法及亚慢性毒性试验方法，具有以下有益效果：本发明通过精进关于聚乙烯醇栓塞微球的制备方法，可以减少或避免制备过程中化学材料可能产生毒性，并对聚乙烯醇栓塞微球进行亚慢性毒性试验，确定试验方法，并得到毒性反应，满足临床使用需求，为聚乙烯醇栓塞微球的临床使用提供了指导作用。
1.一种聚乙烯醇栓塞微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法，其特征在于，在s2和s3之间加入壳聚糖作为交联剂，壳聚糖在ph4～6的酸性条件下与pva溶液反应，壳聚糖的用量为pva质量的5％～10％。
3.根据权利要求1所述的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法，其特征在于，在s3与s4之间，将超声乳化后的乳液加入含乳化剂的外水相进行二次乳化，形成双层乳液。
4.根据权利要求1所述的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法，其特征在于，s1步骤具体包括：称量pva粉末，将去离子水加热至80℃～90℃，将pva粉末溶于去离子水中搅拌至溶解，制备pva溶液浓度为5％～10％w/v，pva粉末的分子量为88000～98000。
5.根据权利要求1所述的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法，其特征在于，s2步骤具体包括：
6.根据权利要求1所述的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法，其特征在于，s3步骤具体包括：
7.根据权利要求1所述的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法，其特征在于，在步骤s4之后还包括s5洗涤和干燥，具体包括：
8.根据权利要求1所述的聚乙烯醇栓塞微球的制备方法，其特征在于，在s4过程中，在硬化过程中还加入化学硬化剂钙离子溶液。
9.一种聚乙烯醇栓塞微球的亚慢性毒性试验方法，基于如权利要求1至8任一所述的制备方法制备的聚乙烯醇栓塞微球，其特征在于，亚慢性毒性试验方法包括：
10.根据权利要求9所述的聚乙烯醇栓塞微球的亚慢性毒性试验方法，其特征在于，饲养期间每天观察评价临床症状以及毒性反应包括呼吸、肌肉运动、痉挛、反射、眼症状、心血管症状、流涎、立毛、痛觉丧失、肌肉状态、胃肠和皮肤状况；
