本发明属于免疫分析，具体涉及一种检测tat的试剂盒制备方法以及提升其检测稳定性的方法。
背景技术：
1、凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex，tat)是体内凝血酶原激活成凝血酶(thrombin，t)，其半衰期仅数秒，因此迅速与抗凝血酶(antithrombin，at)结合，生成共价键相连的无活性不可逆复合物tat，由此维持凝血-抗凝血之间的生理平衡，tat的半衰期为3-15分钟，而能够测定。目前认为该复合物的形成是凝血酶生成的直接证据，标志凝血系统的激活。检测tat的血浆水平可以监测凝血系统的激活情况，是研究生理病理状态下凝血系统行为的一项重要指标。
2、目前测定tat的方法主要有酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、磁微粒化学发光法。酶联免疫吸附法和放射免疫分析法存在明显缺点，酶联免疫吸附法存在检测时间长，灵敏度低，批间次差异大等问题，放射免疫分析法存在会出现交叉反应、假阳性、放射性污染等问题。目前化学发光法测定血液tat含量使用的标记物大多为碱性磷酸酶，属于酶促发光类型，需要通过酶催化底物发光，发光速度较慢，其发光达到峰值需要经过一段时间的孵育反应，这不仅增加了检测的步骤，还延长了检测时间。血液样本中的tat不稳定，需在短时间内进行检测，如果检测时间长会导致血液样本中tat检测结果不准确。而吖啶酯标记物优势在于其标记相对简单，无需催化剂或增强剂，发光机制是基于过氧化氢溶液和氢氧根的反应下，吖啶酯水解发光，1秒以内可以发光完成，属于闪光型，本底低，信噪比高。该检测方法解决了检测时间长的问题，并具有灵敏高、准确高、稳定性强、检测时间短、结果可靠、成本低等优点。
3、市面上检测tat的试剂盒没有统一的检测标准，导致试剂盒检测tat的稳定性和准确性都不高。影响其准确性和稳定性的因素有吖啶酯、缓冲液和血液中游离的抗凝血酶单体。吖啶酯根据其吖啶环上取代物不同可分为吖啶酯和吖啶磺酰胺两大类，不同的取代基与标记抗体结合的稳定性不同，吖啶酯的种类影响试剂的稳定性，进而影响检测的准确性；缓冲液不仅保存试剂，还为检测tat提供一个稳定环境，缓冲液起到保护稳定蛋白的作用，不同配方的缓冲液影响试剂的稳定性，进而影响检测的准确性；血液中有很多游离抗凝血酶单体，目前大多市面上试剂盒不能降低血液中游离抗凝血酶单体对检测tat造成干扰。
4、目前，市面上还未有吖啶酯标记的磁性微球化学发光法检测tat的试剂盒,因此急需一种检测tat的试剂盒及其应用，减少其检测时间，并且提高其检测稳定性和准确性。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明提供一种化学发光法检测tat的试剂盒制备方法及其应用。本发明筛选出一种与抗凝血酶单抗结合最稳定的吖啶酯；本发明筛选出一种最佳缓冲液配方保存试剂rm、试剂r1，增加其稳定性，进而提高试剂盒检测tat的准确性；本发明通过两步两清洗法降低了血液中游离的抗凝血酶单体对检测tat造成干扰。本试剂盒检测tat，具有操作过程简单、灵敏度高、准确性高、稳定性强、检测时间短、结果可靠、成本低等优点。
2、本发明提供一种检测tat的试剂盒，包括：试剂rm、试剂r1，所述r1包括吖啶酯标记的抗凝血酶单抗的工作液，所述吖啶酯为nsp-sa-nhs，结构式：
3、
4、所述rm包括凝血酶抗体包被的磁性微球的工作液。
5、进一步地，在所述试剂盒中，还包括缓冲液，所述缓冲液包括na2hpo4、nah2po4、nacl、bsa、casein、海藻糖、proclin。所述na2hpo4、nah2po4、nacl提供一种工作环境，起缓冲的作用，bsa起封闭作用，casein、海藻糖起稳定、保护蛋白的作用，proclin起防腐作用。
6、进一步地，在所述试剂盒中，所述试剂还包括试剂r2，所述试剂r2包括阻断剂的工作液，所述阻断剂的作用为阻断特定干扰因素，确保检测的准确性和可靠性。
7、进一步地，在所述试剂盒中，所述试剂还包括清洗剂，所述清洗剂为pbs。
8、进一步地，在所述试剂盒中，所述试剂rm中凝血酶抗体包被的磁性微球浓度为0.4mg/ml、试剂r1中吖啶酯标记的抗凝血酶抗体为0.1mg/l、试剂r2中阻断剂为0.1mg/ml，所述试剂r1、r2、r3浓度由缓冲液稀释。
9、另一方面，本发明提供了一种磁性微球化学发光检测tat的方法，所述试剂rm、试剂r1、试剂r2采用前处理后再进行检测，所述两步清洗法包括以下步骤：
10、(1)取待测样品与r2、rm混合，孵育后清洗；
11、(2)加入r1，孵育后清洗。
12、进一步地，在步骤(1)中，所述清洗剂是pbs，经过第一步清洗，血液样本中游离的抗凝血酶单体被洗去，避免了游离抗凝血酶对tat检测的干扰。
13、进一步地，在步骤(2)中，所述清洗剂是pbs，经过第二步清洗，多余吖啶酯被洗去，降低游离吖啶酯对tat检测的干扰。
14、再一方面，本发明提供了一种可与抗凝血酶单抗形成稳定结合的吖啶酯，其所述吖啶酯为nsp-sa-nhs，结构式：
15、
16、吖啶类化合物根据其吖啶环上取代物不同分为两大类吖啶酯和吖啶磺酰胺，它们与不同抗体结合后稳定性不同，具体细分为6种，但能用作化学发光标记的只有4种。其为吖啶酯为dmae-nhs，其结构式：
17、
18、nsp-dmae-nhs，结构式：
19、
20、吖啶磺酰胺为nsp-sa-nhs，结构式：
21、
22、nsp-sa-adh，结构式：
23、
24、这4种吖啶酯/吖啶磺酰胺都常作为化学发光标记物，但与抗凝血酶抗体的结合能力不同。吖啶酯nsp-dmae-nhs、dmae-nhs具有酰基和磺酸基团，可使抗体偶联的发光强度更高，并且在缓冲液中较稳定；吖啶磺酰胺nsp-sa-nhs具有磺酰胺基和羧基结构空间位阻大，水解稳定性好，热稳定性和信噪比高；nsp-sa-adh具有酰肼基团，其末端的活性基团与含有醛基的抗体发生反应。本发明通过研究证明，吖啶酯nsp-sa-nhs与抗凝血酶单抗结合更稳定，可能与其有磺酰胺基和羧基与抗体结合有关。
25、再一方面，本发明提供了一种缓冲液用于制备提高磁性微球-凝血酶单抗结合物稳定性的试剂以及吖啶酯-抗凝血酶抗体结合物稳定性的试剂的方法，所述缓冲液包括ph7.2±0.1、5.75g/l na2hpo4、11.5g/l nah2po4、9g/l nacl、10g/l bsa、5g/l casein、20g/l海藻糖、0.3ml/l proclin。吖啶酯的稳定性受到ph、温度、光照条件等影响，抗体的活性受到ph、温度等影响。该缓冲液提供一种工作和保存环境，使试剂rm中磁性微球-凝血酶抗体结合物以及试剂r1中吖啶酯-抗凝血酶单抗结合物长期稳定保存，并且该缓冲体系能更好稳定tat，使检测结果更稳定准确。
26、本发明提供的一种检测tat的试剂盒制备方法以及提升其检测稳定性的方法，具有以下效果：
27、1、本发明筛选出一种可与抗凝血酶抗体更稳定结合的吖啶酯，延长试剂r1的保存时间，进而提高检测tat的稳定性和准确性。
28、2、本发明提供一种缓冲液配方，保护吖啶酯-抗凝血酶抗体结合物和磁性微球-凝血酶结合物的结构，延长试剂r1、试剂rm的保存时间，进而提高检测tat的稳定性和准确性。
29、3、本发明提供一种清洗方法，两步两清洗法。通过第一步清洗降低样本中游离抗凝血酶对检测tat的干扰；通过第二步清洗降低多余吖啶酯对检测tat的干扰，进而提高了检测tat的准确性。
30、4、本发明提供一种吖啶酯标记的磁性微球化学发光法检测tat的方法，具有偶联标记过程简单、灵敏度高、准确性高、稳定性强、检测时间短、结果可靠、成本低等优点，在临床检测和用药指导方面具有重要作用。
1.一种检测tat的试剂盒，其特征在于，包括：试剂rm、试剂r1，所述r1包括吖啶酯标记的抗凝血酶单抗的工作液，所述吖啶酯为nsp-sa-nhs，结构式：
2.根据权利要求1所述的检测tat试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液，所述缓冲液包括na2hpo4、nah2po4、nacl、bsa、casein、海藻糖、proclin。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括试剂r2，所述试剂r2包括阻断剂的工作液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括清洗剂，所述清洗剂为pbs。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂rm中凝血酶抗体包被的磁性微球浓度为0.4mg/ml、试剂r1中吖啶酯标记的抗凝血酶抗体浓度为0.1mg/l、试剂r2中阻断剂浓度为0.1mg/ml。
6.一种磁性微球化学发光检测tat的方法，其特征在于，采用如权利要求1～5任一项所述的试剂盒进行检测。
7.根据权利要求6所述的试剂盒的方法，其特征在于，试剂rm、试剂r1、试剂r2采用前处理后再进行检测，所述两步清洗法包括以下步骤：
8.一种吖啶酯用于制备提高吖啶酯-抗凝血酶单抗复合物稳定性的试剂的用途，其特征在于，所述吖啶酯为nsp-sa-nhs，结构式：
9.一种缓冲液用于制备提高磁性微球-凝血酶单抗复合物稳定性的试剂以及吖啶酯-抗凝血酶抗体复合物稳定性的试剂，其特征在于，所述缓冲液包括ph7.2±0.1、5.75g/lna2hpo4、11.5g/l nah2po4、9g/l nacl、10g/l bsa、5g/l casein、20g/l海藻糖、0.3ml/lproclin。
10.一种清洗剂用于制备降低游离抗凝血酶或游离吖啶酯对tat检测的干扰的试剂的用途，其特征在于，所述清洗剂为pbs；所述清洗剂需进行两步清洗，所述两步清洗法包括以下步骤：
