本发明涉及化学生物，具体涉及一种用于稠环内酯化合物合成的羰基还原酶chkred20突变体及应用。
背景技术：
1、以绿色化学及可持续发展为原则的指导下，开发新型生物催化剂用于高效高选择性合成手性稠环内酯化合物亟待解决。内酯骨架是构成许多天然化合物和高价值医药中间体的重要结构单元。目前，用于催化合成手性稠环内酯化合物的催化剂大多使用较为昂贵的贵金属-配体手性催化剂，且手性金属配体催化剂合成复杂，存在催化反应条件苛刻、污染大等问题。因此，开发具有高转化率、高选择性、污染小、能耗低、反应条件温和等特点的生物催化剂具有实际应用意义。目前，只有少数研究报道了使用生物催化剂不对称合成稠环内酯，且受限于辅酶循环体系复杂、底物专一性强、催化过程不稳定性等。因此基于天然酶蛋白的工程化改造在高效合成复杂化合物分子上具有重要意义。
2、蛋白质工程在改造酶以增强稳定性、扩大底物识别范围、调控反应选择性等性能优化上应用广泛。然而，通过定向进化改造酶并优化其催化性能的同时，单一催化性能的提升往往会伴随着其他性能的降低，如改变酶的柔性结构以实现大体积化合物识别，酶的热稳定性和酸碱稳定性会相应降低等。目前还未有通过定向进化改造酶以实现稠环内酯手性调控的报道。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种用于稠环内酯化合物合成的羰基还原酶chkred20突变体及应用，以解决现有缺乏通过定向进化改造酶以实现手型稠环内酯化合物高效高选择性合成的问题。
2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
3、一种用于稠环内酯化合物合成的羰基还原酶chkred20突变体，以羰基还原酶突变株chkred20-m2或chkred20-m3c1的氨基酸序列为出发序列，将第188位和/或第145位的氨基酸进行突变；
4、其中，以羰基还原酶突变株chkred20-m2的氨基酸序列为出发序列，将第188位的酪氨酸突变为天冬酰胺；
5、以羰基还原酶突变株chkred20-m2的氨基酸序列为出发序列，将第188位的酪氨酸突变为甘氨酸；
6、以羰基还原酶突变株chkred20-m2的氨基酸序列为出发序列，将第188位的酪氨酸突变为半胱氨酸；
7、以羰基还原酶突变株chkred20-m2的氨基酸序列为出发序列，将第188位的酪氨酸突变为丝氨酸，将第145位的组氨酸突变为丙氨酸；或以chkred20-m3c1的氨基酸序列为出发序列，将第145位的组氨酸突变为丙氨酸；
8、以羰基还原酶突变株chkred20-m2的氨基酸序列为出发序列，将第188位的酪氨酸突变为半胱氨酸，将第145为的组氨酸突变为丙氨酸。
9、本发明的有益效果为：本发明利用pcr技术、单点饱和突变和定点突变技术对来源于金黄杆菌ca49(chryseobacterium sp.ca49)的羰基还原酶chkred20的突变体m2进行分子改造，获得了数株能够高效不对称合成手性三稠环内酯的羰基还原酶chkred20突变体，并在进一步的突变设计中获得了能够翻转三稠环内酯构型的羰基还原酶chkred20突变体，实现了大体积稠环内酯的高效和高选择性不对称合成，实现了稠环内酯的手性翻转。
10、上述羰基还原酶chkred20突变体在稠环内酯化合物合成中的应用。
11、采用上述羰基还原酶chkred20突变体合成稠环内酯化合物的方法，包括以下步骤：将底物化合物和羰基还原酶chkred20突变体分散于溶剂中进行酶催化反应，制得。
12、进一步地，所述底物化合物包括和中任意一种；
13、其中，r1为卤素；
14、r2为卤素、meo和me中的任意一种；
15、r3为卤素或no2；
16、x为o或s。
17、优选地，r1为f、cl、br和i中的任意一种；
18、r2为f、cl、meo和me中的任意一种；
19、r3为br或no2；
20、x为o或s。
21、进一步地，底物化合物的浓度为2-10mmol/l，羰基还原酶chkred20突变体的浓度为0.5-2mol％。
22、优选地，底物化合物的浓度为8mmol/l，羰基还原酶chkred20突变体的浓度为1mol％。
23、进一步地，溶剂为pbs缓冲液和异丙醇混合溶剂，pbs缓冲液和异丙醇的体积比为80-120：5-20。
24、优选地，溶剂为pbs缓冲液和异丙醇混合溶剂，pbs缓冲液和异丙醇的体积比为100：10。
25、进一步地，酶催化反应的条件为：35-40℃下反应30-60h。
26、优选地，酶催化反应的条件为：37℃下反应48h。
27、本发明具有以下有益效果：
28、本发明通过定向进化对chkred20进行了理性设计，成功实现了野生型chkred20及其突变体chkred20-m2不能催化的还原反应，理性设计得到的突变株具有较为广泛的底物普适性，实现了大体积稠环内酯的高效和高选择性不对称合成，实现了稠环内酯的手性翻转。
1.一种用于稠环内酯化合物合成的羰基还原酶chkred20突变体，其特征在于，以羰基还原酶突变株chkred20-m2或chkred20-m3c1的氨基酸序列为出发序列，将第188位和/或第145位的氨基酸进行突变；
2.权利要求1所述的羰基还原酶chkred20突变体在稠环内酯化合物合成中的应用。
3.采用权利要求1所述的羰基还原酶chkred20突变体合成手性内酯化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将底物化合物和羰基还原酶chkred20突变体分散于溶剂中进行酶催化反应，制得。
4.根据权利要求3所述的合成稠环内酯化合物的方法，其特征在于，所述底物化合物包括中任意一种；
5.根据权利要求3所述的合成稠环内酯化合物的方法，其特征在于，所述底物化合物的浓度为2-10mmol/l，所述羰基还原酶chkred20突变体的浓度为0.5-2mol％。
6.根据权利要求3所述的合成稠环内酯化合物的方法，其特征在于，所述溶剂为pbs缓冲液和异丙醇混合溶剂，pbs缓冲液和异丙醇的体积比为80-120：5-20。
7.根据权利要求3所述的合成稠环内酯化合物的方法，其特征在于，所述酶催化反应的条件为：35-40℃下反应30-60h。
