本发明涉及一种体细胞重编程方法，特别是一种通过在3维(3d)悬浮培养中对体细胞(尤其是人体细胞)进行重编程来诱导多能干细胞产生的方法。
背景技术：
1、源自胚泡的人类胚胎干细胞(esc)表现出多能性，例如自我更新潜力和分化产生所有胚层细胞的能力1。胚胎干细胞的多能性特征有望用于产生在研究或临床中应用的不同细胞衍生物。随后该领域的进展导致了诱导多能干细胞(ipsc)的发现，其中终末分化的体细胞可以通过oct4、klf4、sox2和c-myc(oksm)介导的核重编程，恢复到类似于esc的多能状态2。人类ipsc的革命性发现避免了与人类esc产生相关的许多伦理问题，其与人类esc的相似性则使ipsc成为细胞治疗和再生医学应用中的潜在替代品3,4。
2、迄今为止，已经报道了用于生成ipsc的不同重编程方法及进展，其旨在提高ipsc的安全性、稳定性、质量和数量，以满足目前ipsc细胞衍生物制造的临床要求。例如，已开发出非整合病毒/mrna/游离型/蛋白质重编程方法来生成无转基因ipsc，以替代传统的整合慢病毒/逆转录病毒重编程方法2,5-10。此外，据报道，对重编程过程的改良，例如通过加入水凝胶以提供3维重编程微环境，可增强重编程11、12。在ipsc培养上，已经开发了三维(3d)培养系统，其中应用大规模生物反应器，以球状体形式培养ipsc；与传统的二维(2d)培养系统(即，单层培养)相比，3d培养系统已被证明在保持多能性方面同样出色，并且能够在更大规模生产ipsc 13-16。
3、尽管ipsc技术已被证明在细胞治疗和再生医学领域很有前景，但在当前领域从体细胞来源产生足够数量的ipsc以满足治疗目的，仍然是一个漫长的过程。本领域需要一种在更短的时间段内具有更大ipsc产出的重编程方法。
技术实现思路
0、发明概述
1、在概念上，将3d重编程和3d培养系统整合，是一种提高ipsc产量的有希望策略。然而，对该整合的可行性研究极为有限，目前主要集中于小鼠成纤维细胞上。在人类体细胞上整合重编程与3d培养系统，迄今尚未有报道。参见例如，doi:10.1038/nmeth.1939(“derivation,expansion and differentiation of induced pluripotent stem cellsin continuous suspension cultures“,2016)，其中公开了在转导oksm重编程因子后的重编程极早期(大约2-3天)，悬浮培养转染的小鼠成纤维细胞，用于产生诱导多能干细胞。作者指出，由于缺失克隆选择，尽管悬浮培养得到了ipsc群体，但该群体是不均一的，包含将影响该群体的后续分化潜能的部分重编程细胞。
2、此外，研究已经指出，尽管小鼠和人细胞可以使用相同的因子组合实现重编程，但两者在重编程程序上有着显著的差异。小鼠细胞的重编程典型地可以在一或两周完成，而人细胞可能需要多达一个月的时间，并且相比于小鼠ipsc，人ipsc具有明显低的转化效率和不同的特征性形态。此外，研究也已经指出，在重编程的早期，多能性因子的实际调节网络在两物种之间显著趋异。这些差异导致很难将小鼠细胞上获得的重编程研究结果推及并适用到人类细胞上。参见，例如，https://doi.org/10.1186/s12864-018-5326-1(“comparison of reprogramming factor targets reveals both species-specificand conserved mechanisms in early ipsc reprogramming”,2018)；和https://reactome.org/pathwaybrowser/#r-hsa-452723&flg＝o43474，doi：10.3180/react_200812.1。
3、为解决上述问题，本发明人在致力于人体细胞的重编程研究中，令人惊奇地发现，在经历间充质-上皮转化(met)的重编程相对早期，引入3d悬浮培养，是实现重编程与3d培养在人类细胞上整合的更为有效策略。在此基础上，本发明人建立了本发明的3维重编程方法。尽管不希望受到任何理论的约束，但认为在met的重编程相对早期，整合3d悬浮培养，将仅允许稳定的重编程细胞继续增殖并产生ipsc球体。由此，基于本发明的方法，无需常规的克隆挑选来排除培养物中顽固的未重编程细胞和不稳定的部分重编程细胞，从而有效地简化了程序。同时，如本公开实施例所示，相比常规2d重编程方法，本发明的方法允许在更短的时间窗内可规模化地产出更为大量且分化潜能更优的稳定ips细胞。
4、因此，在第一方面，本发明提供了一种自人或非人灵长类动物体细胞重编程产生ipsc的方法，所述方法包括：在3d悬浮培养中，自重编程中间体，培养产生重编程的ipsc球体。在本文中，所述方法也称作”本发明的3d重编程方法”。在本文中，根据本发明的3d重编程方法产生的ipsc,也称作“3d重编程的ipsc”。
5、在一些实施方案中，根据本发明的3d重编程方法包括以下步骤：
6、(a)对体细胞进行重编程处理，使体细胞与重编程因子接触；
7、(b)将步骤(a)的经处理的体细胞，在2d培养条件下，培养足以获得重编程中间体的一段时间，其中所述重编程中间体的特征在于，至少20％、30％、40％或50％的细胞为经历met转化的ipsc前体细胞；
8、(c)收获步骤(b)的重编程中间体，在3d悬浮培养条件下，在液体培养基中培养，以形成重编程的ipsc球体，
9、其中，所述体细胞是来自非人灵长类动物或人的体细胞。
10、在一些实施方案中，所述重编程中间体中，经历met转化的ipsc前体细胞丢失原始体细胞的形态学特征，并呈现出以圆顶穹窿状致密细胞集落和任选地增加的核质比为特征的met形态。优选地，所述经历met转化的ipsc前体细胞表达多能性标志物，tra-1-60和/或ssea3。
11、在一些实施方案中，根据本发明方法的步骤(c)包括，在重编程的约第7天至约第21天，收获重编程中间体，更优选在重编程的约第10天至约第18天，例如，在第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天，收获重编程中间体。
12、在一些实施方案中，用于本发明方法的体细胞是来自成年个体的体细胞或细胞系。在一些优选的实施方案中，所述体细胞是人血液细胞，例如，人pbmc。在另一些优选的实施方案中，所述体细胞是人成纤维细胞。
13、在一些实施方案中，在根据本发明方法的步骤(c)中，所述3d悬浮培养为搅拌或旋转悬浮培养系统，例如，转瓶、轨道摇床或生物反应器。
14、在一些实施方案中，根据本发明方法的步骤(c)还包括，在悬浮培养一段时间后，将形成的细胞球体，传代至少一代，优选至少2代、3代，以获得稳定的ips细胞群体。
15、在一些实施方案中，用于本发明的重编程因子是重编程转录因子，且所述步骤(a)包括，将一种或多种重编程因子或编码所述重编程因子的核酸引入所述体细胞，以增加所述重编程因子在所述体细胞中的表达或蛋白量。
16、在一些实施方案中，根据本发明方法的步骤(a)包括，以整合型病毒或非整合型病毒、或以mrna、游离型质粒或蛋白质的形式，向体细胞递送所述重编程因子。在一些优选的实施方案中，所述步骤(a)包括，使用非整合型病毒，尤其是仙台病毒载体，向所述体细胞递送所述的重编程因子。
17、在一些实施方案中，用于本发明方法的一种或多种重编程因子包括或由klf4，c-myc，oct3/4，sox2，nanog和lin28中的至少三种或至少四种组成；且优选地，所述一种或多种重编程因子包括或由oct3/4，sox2，c-myc和klf4组成。
18、在一些实施方案中，根据本发明方法的步骤(c)包括，以30-100rpm的转速，悬浮培养所述重编程中间体，优选地，转速为大约70rpm。优选地，根据本发明方法的步骤(c)，采用ipsc维持培养基(优选地，stemscale psc悬浮培养基)进行所述3d培养。
19、在第二方面，本发明提供一种在3d培养系统中维持或扩增3d重编程的ipsc的方法。该方法可规模放大，以适应于大规模ipsc生产。
20、在一些实施方案中，根据本发明的用于维持或扩增3d重编程ipsc的方法包括：
21、(i)使用根据本发明的3d重编程方法，自体细胞获得重编程的ipsc球体；以及
22、(ii)在3d悬浮培养条件下维持或扩增所述ipsc。
23、在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(i)后以及步骤(ii)前的细胞传代步骤。
24、在一些实施方案中，所述传代步骤包括，在所述ipsc球体的大小达到300-500um之间，进行细胞传代。
25、在一些实施方案中，所述方法步骤(ii)中，所述ipsc的维持培养包括，每4-6天传代细胞一次。优选地，在细胞传代的最初12-48小时(优选24小时)中，在培养基中加入rock抑制剂，优选y27632。在一些实施方案中，所述细胞传代包括，自ipsc球体，产生单细胞或不超过200个细胞的细胞团块，并重接种。优选地，通过酶解(例如accutase酶)，自ipsc球体产生ipsc单细胞悬液，用于细胞传代。
26、在第三方面，本发明提供了一种用于生产下游细胞衍生产品的方法，所述方法包括：通过本发明的3d重编程方法获得3d重编程的ipsc，和使用所述的ipsc生产下游细胞衍生产品。由于根据本发明的3d重编程方法可以提供高产量的3d重编程的ipsc，因此，适应于下游细胞衍生产品的大量生产。
27、本发明方法的优势
28、·通过本发明方法，在重编程过程中整合3d培养，可以生成更高质量的ipsc。
29、·通过本发明方法，在重编程过程中整合3d培养，允许在重编程的同时进行大规模扩增；与2维重编程和培养方法相比，可以在更短的时间内产生更高的ipsc细胞产量。
1.一种从体细胞重编程产生ipsc的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1的方法，其中，所述经历met转化的ipsc前体细胞丢失原始体细胞的形态学特征，并呈现出以圆顶穹窿状致密细胞集落和任选地增加的核质比为特征的met形态。
3.根据权利要求1-2的方法，其中，所述经历met转化的ipsc前体细胞表达多能性标志物，tra-1-60和/或ssea3。
4.根据权利要求1-3的方法，其中步骤(c)包括，在重编程的约第7天至约第21天，收获重编程中间体，更优选在重编程的约第10天至约第18天，例如，在第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天，收获重编程中间体。
5.根据权利要求1-4的方法，其中，所述体细胞是来自成年个体的体细胞或细胞系。
6.根据权利要求1-5的方法，其中体细胞是人血液细胞，例如，人pbmc。
7.根据权利要求1-5的方法，其中体细胞是人成纤维细胞。
8.根据权利要求1-7的方法，其中，步骤(c)，所述3d悬浮培养为搅拌或旋转悬浮培养系统，例如，转瓶、轨道摇床或生物反应器。
9.根据权利要求1-8的方法，其中，步骤(c)还包括，在悬浮培养一段时间后，将形成的细胞球体，传代至少一代，优选至少2代、3代，以获得稳定的ips细胞群体。
10.根据权利要求1-9的方法，其中，所述重编程因子是重编程转录因子，且步骤(a)中，将一种或多种重编程因子或编码所述重编程因子的核酸引入所述体细胞，以增加所述重编程因子在所述体细胞中的表达或蛋白量。
11.根据权利要求1-10的方法，其中，步骤(a)包括，以整合型病毒或非整合型病毒、或以mrna、游离型质粒或蛋白质的形式，向体细胞递送所述重编程因子，
12.根据权利要求1-11的方法，其中，所述一种或多种重编程因子包括或由klf4，c-myc，oct3/4，sox2，nanog和lin28中的至少三种或至少四种组成；
13.根据权利要求1-12的方法，其中，步骤(c)包括，以30-100rpm的转速，悬浮培养所述重编程中间体，优选地，转速为大约70rpm。
14.根据权利要求1-13的方法，其中，步骤(c)中，所述3d培养采用ipsc维持培养基(优选地，stemscale psc悬浮培养基)进行。
15.一种用于维持或扩增3d重编程的ipsc的方法，包括：
16.根据权利要求15的方法，其中，所述方法还包括，在步骤(i)后以及步骤(ii)前的细胞传代步骤。
17.根据权利要求15-16的方法，其中，在所述ipsc球体的大小达到300-500um之间，进行细胞传代。
18.根据权利要求15-17的方法，其中，所述ipsc维持培养包括，每4-6天传代细胞一次，
19.根据权利要求15-18的方法，其中，所述细胞传代包括，自ipsc球体，产生单细胞或不超过200个细胞的细胞团块，并重接种；
20.一种用于生产下游细胞衍生产品的方法，所述方法包括：通过权利要求1-19任一项的方法，获得ipsc，和使用所述的ipsc生产下游细胞衍生产品。
