本发明涉及分子检测领域，具体地，涉及一种新型冠状病毒全基因组检测组合物、试剂盒及文库构建方法。
背景技术：
1、
2、全基因组测序对于covid-19的监测是至关重要的，以了解新型sars-cov-2变异株的病毒变异率和传播动力学，为sars-cov-2传播的控制和预防措施的实施提供信息。同时，追踪sars-cov-2变异株的基因多样性有助于研究疾病发病机制，同时识别基因组上可能降低疫苗和药物治疗有效性的位点，最终为未来疗法的设计提供信息。目前，许多方法已被用于sars-cov-2全基因组测序，包括宏基因组测序和靶向测序。宏基因组测序即鸟枪法基因测序，广泛用于病原体检测及环境/临床样本中微生物多样性的分析，其优势在于无需病毒基因组的先验知识，有利于发现新的病毒；其缺点在于易受宿主及其他微生物核酸影响，检测灵敏度降低。靶向测序主要分为两种：基于多重引物pcr扩增的扩增子测序和基于探针杂交的探针捕获测序。探针捕获测序先对样本进行常规宏基因组文库构建，再用人工合成的，含有一系列已知病毒序列的寡核苷酸探针对文库病毒序列进行杂交富集，最后对富集完成的文库进行pcr扩增后上机测序。此方法灵敏度较高，检测特异性取决于探针的种类与数量，但是价格昂贵、操作复杂、耗时极长，同时具有更高的背景噪音。多重pcr扩增子测序是目前应用最广的测序方法，将覆盖整个sars-cov-2基因组的几十对特异引物组成两个引物池，分别对病毒基因组进行扩增，再用高通量测序方法对扩增产物进行测序。该方法操作简单灵敏度较高，只需要很小的数据量即可获得病毒全基因组。
3、随着全球covid-19的传播，sars-cov-2不断变异，呈现出核苷酸突变位点逐渐增多以及突变在基因组中差异分布的特征。而新型变异株的产生是由多个突变的组合决定的，其中以发生在编码刺突s蛋白基因内的突变为主。除xbb.1.5和xbb.1.16外，who又追踪到具有独特突变和增强传播性的新变异株eg.5及其子代毒株，并于2023年8月9日将其定义为关注变异株(voc)，是xbb.1.9.2的子代谱系，跟xbb.1.9.2和xbb.1.5相比，s蛋白区携带f456l突变，子代eg.5.1还表现出q52h突变。此外，2023年8月17日，who将一种新的新冠变异株ba.2.86纳入监测变异株(vum)。据悉ba.2.86携带大量(>30)的刺突基因突变。以上这些突变若发生在多重pcr扩增引物结合位点内，可以阻止引物退火并导致扩增子的丢失和关键区域的覆盖率降低，从而在缺失扩增子区域产生插入n的低质量基因组，造成不准确的谱系分析结果，并使监测voc中的谱系特定突变变得具有挑战性。
4、为了保证不断进化的sars-cov-2变异株扩增子测序的准确性，根据最新变异毒株设计多重pcr扩增反应引物是必要的。因此，本领域需要一种产品，能够检测最全的新冠基因组。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的第一方面在于提供一种新型冠状病毒全基因组检测的组合物，所述组合物包括：
2、如seq id no:1～192所示的寡核苷酸。
3、进一步地，所述组合物包括进一步包括根据测序接头设计的引物对。
4、上述根据测序接头设计(即，第二轮pcr扩增引物对)根据不同的测序平台可以由本领域技术人员按照本领域常规方法确定。
5、本发明的组合物一方面可用于构建新冠病毒全基因组基因文库，另一方面可用于提高新冠病毒测序的成功率。
6、进一步地，所述引物组包括针对sars-cov-2变异株的全基因组序列设计的96对叠瓦式pcr扩增引物，包括第一引物组和第二引物组。其中，第一引物组包括48对扩增引物，具体序列如seq id no.1-96；第二引物组包括48对扩增引物，具体序列如seq id no.97-192。
7、考虑不同多重pcr扩增产物的平衡性，以株nc_045512作为参考基因组，并将其与sars-cov-2alpha、beta、delta、gamma以及2023年1月-8月境外输入的多个新型omicron变异序列进行比对，针对比对后序列的保守区域设计了96对叠瓦式pcr扩增引物，更新了多重rcr扩增的引物池，避免了扩增子的丢失，扩增效率增高，每对扩增引物的扩增产物为400bp左右。该检测引物组中扩增引物相邻的引物扩增区之间存在100bp左右的交叠区，以对病毒基因组进行完整的覆盖。本发明在illumina二代测序和齐碳公司开发的第三代便携式纳米孔基因测序中，分别实现了所有扩增区域>100倍和>30倍的覆盖深度。
8、第一方面，第一轮pcr的高特异性保证了模板的高效利用，二代和/或三代测序(即第二轮pcr)提高文库序列浓度，因此，在使用本发明的组合物进行突变检测时，样品起始量仅需10ng。
9、第二方面，提供了一种使用本发明的组合物制备新型冠状病毒全基因组检测试剂盒的用途。
10、第三方面，本发明提供一种新型冠状病毒全基因组检测的试剂盒，所述试剂盒包括：如上所述的组合物。
11、进一步地，上述试剂盒中还具有提取所需试剂、扩增所需试剂以及测序所需试剂。
12、提取所需试剂是指从样品中提取所需核酸所需的试剂，例如商业化核酸提取试剂盒(可使用达安石蜡基因组dna提取试剂盒，达安全血基因组dna提取试剂盒等)。
13、扩增所需试剂包括第一轮pcr扩增所需的试剂，例如包括聚合酶、缓冲液、dntp等。
14、所述聚合酶优选为适合于长片段扩增的聚合酶，例如，faststart high fidelityenzyme热启动酶。
15、测序所需试剂包括片段化试剂、纯化片段试剂、末端修复和加腺嘌呤试剂、接头连接试剂和测序(第二轮pcr扩增)所需试剂。
16、所述片段化试剂为可以将扩增产物(即扩增子)片段化的试剂，在一个具体实施方案中，所述片段化试剂为双链dna片段化酶。
17、所述纯化片段试剂为可以根据特定需求选择特定长度的片段的试剂，在一个具体实施方案中，所述纯化片段试剂为磁珠。
18、末端修复和加腺嘌呤试剂包括：dntp、t4 pnk、t4 dna聚合酶、klenow片段等。
19、接头连接试剂包括接头和dna连接酶。接头可以根据不同的测序平台而通过常规方法确定。在一个具体的实施方案中，接头序列为：正向接头为gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac，反向接头为tacactctttccctacacgacgctcttccgatct，在一个具体的实施方案中，dna连接酶为t4连接酶。
20、第二轮pcr扩增所需试剂包括：缓冲液、mgso4、dna聚合酶、扩增所需引物对。在一个具体的实施方案中，扩增所需引物对为接头正向引物，例如，aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct；以及接头负向引物，例如caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct。
21、第四方面，本发明提供一种新冠病毒前基因组基因文库的构建方法，所述方法包括：
22、1)使本发明的组合物或试剂盒扩增样品，得到扩增子；
23、2)将所述扩增子片段化；
24、3)纯化片段，并进行末端修复和加腺苷酸；
25、4)连接接头；以及
26、5)二代测序和三代测序中的一种或两种。
27、检测所适用的样品不限制于痰液、肺泡灌洗液、咽腔分泌物和血液。
28、在一个具体的实施方案中，步骤1)中的第一轮pcr扩增将上述组合物或试剂盒分两管进行。
29、在一个具体的实施方案中，步骤2)中所述片段化可以为化学片段化，所述化学片段化为使用可以使dna片段化的化学物质。在一个具体的实施方案中，所述化学片段化为酶切片段化，在一个具体的实施方案中，所述酶切片段化所用的酶为dsdna片段化酶。
30、在一个具体的实施方案中，步骤2)中所述片段化可以为物理片段化，所述物理片段化为使用物理手段使dna片段化。在一个具体的实施方案中，所述物理片段化为物理超声打断。
31、在一个具体的实施方案中，将文库片段化为主峰在300bp，范围在200～400bp的片段。上述片段范围属最适测序长度，能更好的兼容不同长度的测序模式。
32、在一个具体的实施方案中，步骤3)中的纯化片段可以通过调整磁珠液的用量进行，所述的磁珠来源没有特别限定，本领域常规市售产品均可。
33、在一个具体的实施方案中，所述磁珠选自beckman agencurt ampure xp(规格450ml，no.a63882，购自beckman公司)。
34、在一个具体的实施方案中，包括但不限于使用dntp、t4 pnk、t4 dna聚合酶、klenow片段进行步骤3)中的末端修复和加腺嘌呤。
35、在一个具体的实施方案中，包括但不限于使用接头和dna连接酶进行步骤4)。
36、在一个具体的实施方案中，包括但不限于使用缓冲液、mgso4、dna聚合酶、扩增所需引物对进行步骤5)。
37、第五方面，本发明提供了一种根据上述任一项所述的方法获得的新冠病毒全基因组基因文库。
38、进一步地，在建库完成之后，对文库进行测序，以进行突变检测。
39、在一个具体的实施方案中，测序为第二代测序。在一个具体的实施方案中，所述第二代测序的测序平台不限制于illumina、abi-solid或ion torrent相关测序平台测序，测序试剂盒读长不限制于75cycles、150cycles，适用于目前上市的各类型读长测序试剂盒。
40、本发明后端采用打断连接建库方法能适应不同读长测序试剂盒。而常规的pcr扩增建库，其选用的测序试剂盒读长必须不短于最长扩增子长度。本发明所述的方法所建文库有更好的测序平台和测序试剂盒的兼容性，也便于搭载其它文库进行测序，降低测序成本。
1.一种新型冠状病毒全基因组检测的组合物，所述组合物包括：
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，进一步包括根据测序接头设计的引物对。
3.使用如权利要求1或2所述的组合物在制备新型冠状病毒全基因组检测的试剂盒中的用途。
4.一种新型冠状病毒全基因组检测的试剂盒，包括：如权利要求1或2所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，进一步包括片段化所需试剂，优选为dna片段化酶。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，进一步包括纯化片段试剂，优选为磁珠。
7.一种新型冠状病毒全基因组基因文库的构建方法，所述方法包括：
8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤2)中所述片段化为化学片段化或物理片段化。
9.根据权利要求7所述的方法，步骤3)中的纯化片段通过调整磁珠液的用量进行。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的方法获得的新型冠状病毒全基因组基因文库。
