本技术涉及生物检测，具体而言涉及cmb磁珠试剂盒及其在半胱氨酸修饰蛋白组学分析中的应用。
背景技术：
1、蛋白质作为细胞、组织的重要成分，是生命过程中生理功能的重要执行者和生命现象的直接体现者，对蛋白质功能活性的研究将有助于阐明其对生理或病理过程的调控机制，蛋白质组学能够分析获取生命过程中成千上万种蛋白功能活性的信息，可以在大规模水平上鉴定蛋白质的表达水平、修饰水平、相互作用等。
2、半胱氨酸是存在于多数蛋白质中频次较低的氨基酸，但由于其侧链巯基的化学活泼性使其展现出较强的内在活性，也成为多种蛋白质的功能活性位点。蛋白质半胱氨酸残基作为细胞内的还原性物质和与小分子介质作用的重要主体，对于维持和调控细胞内的氧化还原内环境起着重要作用。它们参与调控细胞识别、信号转导等多种生理过程，并与生物体内还原性物质变化的相关疾病有着密切的联系。
3、ros与rns可与半胱氨酸反应，形成几种氧化还原修饰（s-亚硝基化、s-谷胱甘肽化、分子间和分子内二硫键和s-巯基化）。在蛋白质组学领域中以生物素置换法对蛋白质半胱氨酸翻译后修饰进行检测的应用较为广泛，其工作流程一般是通过烷基化试剂如甲基硫代磺酸甲酯(mmts)封闭蛋白质中的游离半胱氨酸，再用选择性试剂(如抗坏血酸)还原半胱氨酸翻译后修饰基团产生新的半胱氨酸，然后用生物素化试剂（biotin-hpdp）标记新产生的半胱氨酸，之后将利用链霉亲和素-生物素亲和纯化蛋白质，最后胰酶消化并进行质谱分析，得到修饰蛋白和位点信息。
4、但是这类方法往往操作繁琐，受多步反应的影响，富集效率较低，且被标记后的半胱氨酸残基必须在肽段水平与链霉素结合富集，在应用于大样本的队列研究时，整个流程需要耗费较长时间，为解决这一问题，特提供一种cmb磁珠试剂盒及其在半胱氨酸修饰蛋白组学分析中的应用。
技术实现思路
1、为解决相关技术中采用生物素置换法对蛋白质半胱氨酸翻译后修饰进行检测时，存在操作繁琐以及大样本队列研究耗时等问题，本技术提供一种cmb磁珠试剂盒及其在半胱氨酸修饰蛋白组学分析中的应用，旨在实现 快速、高效、准确的半胱氨酸修饰蛋白组学分析。
2、第一方面，本技术提供的cmb磁珠试剂盒采用如下技术方案：
3、cmb磁珠试剂盒，由:cmb磁珠，用量0.1-0.2ml/ml样品；n-乙基马来酰亚胺，用量0.8-1ml/ml样品；游离巯基选择性还原剂，用量0.6-0.8ml/ml样品；硫醇类还原剂，用量20-25μl/ml样品；含有4% sds（w/v）的pbs缓冲液；pbs缓冲液构成。
4、通过采用上述技术方案：为蛋白质组学研究提供了一种快速、高效、准确的新方法，能够实现稳定高通量地检测。
5、究其原因，可能为：cmb磁珠的特异性结合和磁性分离，实现了对半胱氨酸修饰蛋白的快速富集和分离，大大简化了操作步骤，提高了分析效率，而nem封闭未修饰巯基和选择性还原特定修饰类型，减少了非特异性结合和背景干扰，提高了分析的准确性，并且适用于不同类型和程度的半胱氨酸修饰蛋白的富集和分析，具有较广泛的适用性。
6、优选的，所述cmb磁珠为活化巯基磁珠，该活化巯基磁珠为表面结合有2-吡啶基二硫化物的超顺磁性球体，其中每克cmb磁珠结合25-35μmol的2-吡啶基二硫化物。
7、通过采用上述技术方案：cmb磁珠的设计基于巯基-二巯基交换反应，这是一种酶偶联反应，在此反应中，带—sh（巯基）或—s—（二巯基）的载体能够与酶分子上非必需的巯基进行偶联，由于半胱氨酸中也包含巯基，这种化学特性使得cmb磁珠能够与半胱氨酸修饰蛋白发生特异性结合，确保了磁珠与半胱氨酸修饰蛋白之间的高亲和力结合，从而提高富集效率和检测的灵敏度，并且由于磁珠表面的活化基团具有特定的化学结构，它们能够减少与样本中非半胱氨酸修饰蛋白的非特异性结合，这种选择性结合有助于降低背景噪音，使得目标半胱氨酸修饰蛋白的检测结果更加准确可靠，此外还能进一步简化实验流程，减少操作步骤和试剂消耗，提高实验效率。
8、优选的，所述cmb磁珠的粒径大小为0.2-0.4μm。
9、通过采用上述技术方案：确保磁珠具有足够的比表面积来有效地与蛋白质相互作用，同时也便于后续的磁分离操作。
10、优选的，所述游离巯基选择性还原剂为羟胺和/或抗坏血酸钠。
11、通过采用上述技术方案：这两种还原剂在适当的条件下能够迅速还原目标半胱氨酸修饰，从而加速实验进程，提高效率。
12、优选的，所述硫醇类还原剂为三(2-羧乙基)膦。
13、通过采用上述技术方案：将三(2-羧乙基)膦作为硫醇类还原剂，可以提高cmb磁珠试剂盒在半胱氨酸修饰蛋白组学分析中的性能，确保实验的准确性和高效性。
14、第二方面，本技术提供的cmb磁珠试剂盒在半胱氨酸修饰蛋白组学分析中的应用；
15、在用于半胱氨酸修饰蛋白组学分析时，按照以下步骤进行：
16、s1、取适量待测蛋白，加入硫醇类还原剂，37℃反应1小时，再加入n-乙基马来酰亚胺，3-5℃孵育过夜，得混合物a；
17、s2、向混合物a中加入丙酮，-20℃放置数小时，离心后弃上清，用甲醇清洗沉淀物，干燥后得沉淀物b；
18、s3、用含有百分比浓度为4% sds（w/v）的pbs缓冲液复溶沉淀物b，加入游离巯基选择性还原剂，得混合物c，取用cmb磁珠并洗涤，随后加入混合物c中孵育，孵育完成后洗涤，再加入碳酸氢铵溶液和硫醇类还原剂反应，收集上清液，即得特异性蛋白溶液，可用于质谱分析。
19、优选的，在用于半胱氨酸修饰蛋白组学分析时，按照以下步骤进行：
20、a1、取适量待测蛋白，加入硫醇类还原剂，37℃反应1小时，再加入n-乙基马来酰亚胺，3-5℃孵育过夜，得混合物a；
21、a2、向混合物a中加入丙酮，-20℃放置数小时，离心后弃上清，用甲醇清洗沉淀物，干燥后得沉淀物b；
22、a3、向a2得到的沉淀物b中加入碳酸氢铵进行复溶，然后加入一定量的胰蛋白酶，轻微混匀后孵育16-18h，待酶解完成后，对肽段进行脱盐处理，用含有百分比浓度为4% sds（w/v）的pbs缓冲液复溶脱盐后的肽段，得混合物d，取用cmb磁珠并洗涤，随后与游离巯基选择性还原剂一同加入混合物d中，室温孵育3h，孵育完成后洗涤，再加入碳酸氢铵溶液和硫醇类还原剂反应，收集上清液，即得特异性的含有氧化还原位点的肽段溶液，后续可对该肽段溶液进行质谱分析。
23、通过采用上述技术方案：本技术提供的cmb磁珠试剂盒可以高效、准确地富集和分析待测蛋白中的半胱氨酸修饰情况，为半胱氨酸修饰蛋白组学研究提供有力支持。
24、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：
25、1、本技术通过使用能够直接与自由巯基特异性结合的cmb磁珠作为富集材料，省略了传统的实验过程中生物素标记的过程，可以大幅缩短实验流程，节省实验时间，有利于获得大样本的队列研究，保持稳定高通量地检测；
26、2、本技术的cmb磁珠试剂盒在使用时，既可以在蛋白水平也可以在肽段水平与半胱氨酸自由巯基结合富集，其应用具有广泛性。
1.cmb磁珠试剂盒，其特征在于，所述磁珠试剂盒由:cmb磁珠，用量0.1-0.2ml/ml样品；n-乙基马来酰亚胺，用量0.8-1ml/ml样品；游离巯基选择性还原剂，用量0.6-0.8ml/ml样品；硫醇类还原剂，用量20-25μl/ml样品；含有百分比浓度为4% sds的pbs缓冲液；pbs缓冲液构成。
2.根据权利要求1所述的cmb磁珠试剂盒，其特征在于，所述cmb磁珠为活化巯基磁珠，该活化巯基磁珠为表面结合有2-吡啶基二硫化物的超顺磁性球体，其中每克cmb磁珠结合25-35μmol的2-吡啶基二硫化物。
3.根据权利要求1所述的cmb磁珠试剂盒，其特征在于，所述cmb磁珠的粒径大小为0.2-0.4μm。
4.根据权利要求1所述的cmb磁珠试剂盒，其特征在于，所述游离巯基选择性还原剂为羟胺和/或抗坏血酸钠。
5.根据权利要求1所述的cmb磁珠试剂盒，其特征在于，所述硫醇类还原剂为三(2-羧乙基)膦。
6.权利要求1-5中任一所述的cmb磁珠试剂盒在半胱氨酸修饰蛋白组学分析中的应用；
7.权利要求1-5中任一所述的cmb磁珠试剂盒在半胱氨酸修饰蛋白组学分析中的应用；
