本发明涉及细胞驯化，更具体地，涉及了一种细胞无血清悬浮培养方法。
背景技术：
1、细胞无血清悬浮培养是大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，是当前国际上生物制品生产的主流模式。如cho细胞、293t细胞、vero细胞、bhk-21细胞、pk-15细胞、nbl-6细胞或rk-13细胞等贴壁细胞，由于在悬浮培养中具有相对较高的细胞密度和生长速度，可持续稳定地表达目的蛋白质，因此被用作生物制品行业的主要生产用细胞系。
2、上述贴壁细胞从贴壁、依赖牛血清（fbs）培养驯化成无血清悬浮生长的方法主要有直接驯化法和梯度驯化法。直接驯化法细胞结团率高、活率低，驯化失败概率高。而梯度驯化法是逐步减低细胞对牛血清的依赖，以及去除细胞贴壁性能，驯化成功率高，仍存在驯化周期漫长（5~10个月），细胞易成团等缺点。
技术实现思路
1、针对现有技术问题，本发明提出了一种更高效率和效果的悬浮驯化方法，驯化周期为较短，驯化后悬浮细胞倍增时间≤24小时、活性较高，并且细胞不易聚团。
2、为了解决上述技术问题，本发明采用了如下所述的技术方案：
3、一种细胞无血清悬浮培养方法，所述方法包括以下步骤：
4、（1）去血清培养：对细胞进行依次降血清贴壁培养，降至无血清；每次降血清贴壁培养过程中进行至少两次去除贴壁上的细胞的步骤；
5、（2）无血清半悬浮培养：进行多次低速离心去除沉淀的细胞的步骤；
6、（3）无血清全悬浮培养：进行多代悬浮培养，每代悬浮培养过程中逐步提高转速。
7、进一步的，所述去除贴壁上的细胞的步骤具体是：细胞接种至细胞瓶，静止吸附，弃去已吸附在瓶壁上的细胞，收集仍悬浮状的细胞上清，转移至新细胞瓶。
8、进一步的，所述静止吸附的时间≤2h。
9、进一步的，在降至无血清的传代过程中，将细胞培养上清与无血清悬浮培养基等比混合做为生长液。
10、进一步的，所述低速离心去除沉淀的细胞的步骤具体包括：静止培养后的细胞，经吹打分散均匀，采用300~500rpm低速离心，去除沉淀的细胞，将离心上清细胞吹打均匀，继续传代培养。
11、进一步的，离心时间为3~5min。
12、进一步的，所述低速离心去除沉淀的细胞的步骤具体包括：经吹打分散均匀，高速离心，取细胞沉淀用生长液重悬，经300~500rpm离心3~5min，去掉细胞沉淀，收集离心上清细胞，按0.3~0.8*106个/ml接种至细胞瓶，静止培养，每天吹打分散细胞一次，培养2~3天后，再次吹打分散，再次经300~500rpm离心3~5min，去掉细胞沉淀，收集离心上清细胞，继续传代驯化培养。
13、进一步的，低速离心去除沉淀的细胞的步骤进行1~3次。
14、进一步的，所述每代悬浮培养过程中逐步提高转速具体是指：先采用70~90rpm转速悬浮培养适应后，逐渐提高转速至90~110rpm，直至常规转速110~120rpm。
15、进一步的，所述多代悬浮培养重复2~3代，直至细胞培养两天的数量倍增≥3.5倍，活率≥90%。
16、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17、本发明在每次降血清贴壁培养过程中进行至少两次去除贴壁上的细胞的步骤，即采用新创“多次吸附去除法”，不但加快降低fbs使用浓度，而且有效地筛选悬浮生长适应性较强的细胞群体，大大缩短驯化进程，且细胞活率较强；以及无血清半悬浮培养时进行多次低速离心去除沉淀的细胞的步骤，即采用新创“间断离心去除法”，有效去除易结团细胞，获得较分散、均一的悬浮生长细胞，进一步加快驯化进程。
18、本发明的贴壁细胞无血清悬浮驯化方法，可实现多种贴壁细胞的无血清悬浮驯化；同时，驯化周期短（约1个月），细胞倍增时间≤24h，细胞活率高（≥95%），细胞稳定性较好，适用于规模化悬浮培养，更具有商业价值。
1.一种细胞无血清悬浮培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的细胞无血清悬浮培养方法，其特征在于，所述去除贴壁上的细胞的步骤具体是：细胞接种至细胞瓶，静止吸附，弃去已吸附在瓶壁上的细胞，收集仍悬浮状的细胞上清，转移至新细胞瓶。
3.根据权利要求2所述的细胞无血清悬浮培养方法，其特征在于，所述静止吸附的时间≤2h。
4.根据权利要求1所述的细胞无血清悬浮培养方法，其特征在于，在降至无血清的传代过程中，将细胞培养上清与无血清悬浮培养基等比混合做为生长液。
5.根据权利要求1所述的细胞无血清悬浮培养方法，其特征在于，所述低速离心去除沉淀的细胞的步骤具体包括：静止培养后的细胞，经吹打分散均匀，采用300~500rpm低速离心，去除沉淀的细胞，将离心上清细胞吹打均匀，继续传代培养。
6.根据权利要求5所述的细胞无血清悬浮培养方法，其特征在于，离心时间为3~5min。
7.根据权利要求1所述的细胞无血清悬浮培养方法，其特征在于，所述低速离心去除沉淀的细胞的步骤具体包括：经吹打分散均匀，高速离心，取细胞沉淀用生长液重悬，经300~500rpm离心3~5min，去掉细胞沉淀，收集离心上清细胞，按0.3~0.8*106个/ml接种至细胞瓶，静止培养，每天吹打分散细胞一次，培养2~3天后，再次吹打分散，再次经300~500rpm离心3~5min，去掉细胞沉淀，收集离心上清细胞，继续传代驯化培养。
8.根据权利要求5-7任一所述的细胞无血清悬浮培养方法，其特征在于，低速离心去除沉淀的细胞的步骤进行1~3次。
9.根据权利要求1所述的细胞无血清悬浮培养方法，其特征在于，所述每代悬浮培养过程中逐步提高转速具体是指：先采用70~90rpm转速悬浮培养适应后，逐渐提高转速至90~110rpm，直至常规转速110~120rpm。
10.根据权利要求1或9所述的细胞无血清悬浮培养方法，其特征在于，所述多代悬浮培养重复2~3代，直至细胞培养两天的数量倍增≥3.5倍，活率≥90%。
