本发明涉及生物工程领域，尤其涉及mir1858在制备和/或生产二十碳五烯酸中的应用。
背景技术：
1、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, epa）是一种人体必需的重要脂肪酸。脂肪酸分为饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸，其中不饱和脂肪酸又分成单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸两种；多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, pufas）又可以分为omega-3和omega-6两类，最有益（且对工业影响最大）的多不饱和脂肪酸是omega-3的衍生物，其中以二十碳五烯酸（epa，20:5，ω3）、二十二碳六烯酸（dha，22:6，ω3）和α-亚麻酸（ala, 18:3, ω3）为代表。多不饱和脂肪酸是人体必需的脂肪酸，但人体自身无法通过从头合成途径合成ala、epa、dha等多不饱和脂肪酸，因此需要通过摄入富含多不饱和脂肪酸的食物或保健品来补充。
2、epa在维持人体健康中发挥重要作用，包括预防心血管疾病、减轻炎症反应以及促进大脑发育和功能。epa生理功能相关的研究显示，其对人体健康主要有以下益处：（1）预防血栓形成和动脉粥样硬化，改善心血管系统，降低高血压、冠心病等心血管疾病的发生率；（2）减少炎症介质如白三烯和细胞因子等的生成，从而预防炎症，缓解类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、1型糖尿病等自身免疫性疾病；（3）影响神经退行性疾病的发展，是治疗或预防情绪障碍、帕金森病等神经退行性疾病和神经系统疾病的潜在药物；（4）具有抗癌活性，或与多种化疗药物协同作用，改善癌症患者的新陈代谢和身体成分。以上研究结果均表明epa与人类健康和疾病方面密切相关，其作为保健品和潜在药物具有巨大的应用前景。
3、随着人们对健康问题的日益重视，对epa的需求不断增加。epa主要来源于单细胞浮游植物和海藻，并通过食物链传递给其他物种，人类可通过食用鱼类（或鱼油）和其他海洋动物获取epa。然而近年来，海洋环境污染和过度捕捞等因素导致海洋资源日益枯竭，从而使得从海洋动物中获取epa、dha等多不饱和脂肪酸变得更加困难且供应不足。与此同时，全球气候变暖引起表层海水温度升高，大量浮游植物正在慢慢适应高温，从而减少御寒多不饱和脂肪酸的合成，这就导致海洋生态系统中epa的天然合成大量减少。最新调查显示，全球人口每天的epa和dha的需求总量是140万吨，而水产养殖、渔业和其他海洋来源每年可供应的epa和dha是80万吨，以上结果表明epa的供应市场面临着严重缺口。
4、海洋微藻是一类光能自养生物，具有细胞结构简单、繁殖能力强、生长周期短等显著优势，是一种极好的工业生产的底盘生物，因此被视为一种极具潜力的可持续合成epa的天然工厂。与海洋动物相比，微藻的培养条件相对简单，并且通过优化培养条件、开发高效培养系统、改良遗传性状等手段可显著提高微藻的epa产量，为大规模生产提供了可能性。目前海洋微藻已被广泛应用于可再生能源生产、生物医药、食品工业等方面。
5、epa在微藻中的生物合成途径主要分为两个步骤：（1）以乙酸盐为前体合成硬脂酸（18:0），然后δ 9去饱和酶催化硬脂酸生成油酸（18:1 ω-9），随后油酸被δ 12去饱和酶催化形成亚油酸（18:2 ω-6），后者在δ 15去饱和酶的作用下形成α-亚麻酸（18:3 ω-3）；（2）α-亚麻酸经过一系列逐步去饱和和延长步骤变成epa。已发现包括微拟球藻（nannochloropsis oceanica）、三角褐指藻（phaeodactylum tricornutum）、微小小球藻（chlorella minutissima）在内的多种微藻能合成epa，但产量不能满足人类的需求。因此，迫切需要制定工艺优化或代谢工程策略，以提高微藻中epa的产量。
6、近年来，通过过表达与epa合成相关的关键基因以提高epa产量被视为最有前途的策略之一。例如，在微拟球藻中过表达δ 5或δ 12去饱和酶使总脂肪酸中epa的占比增加了25%；在三角褐指藻中过表达δ 5去饱和酶编码基因使epa的产量增加58%，过表达二酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase, dgat2）使脂肪酸中epa的含量增加到76.2%；在杜氏盐藻（dunaliella salina）中异源过表达假威氏海链藻（thalassiosirapseudonana）的δ 6去饱和酶编码基因使epa的产量达到21.3 mg/l。以上策略聚焦于对epa合成的关键编码节点进行遗传改造，然而尚未有通过在非编码水平进行遗传改造以提高epa产量的相关技术。
7、微小rna（microrna, mirna）是长度在19-25个核苷酸的一类小型单链rna，属于内源保守非编码rna，具有调控基因表达的功能。mirna是一种重要的转录后调节剂，其通过与argonaute家族蛋白形成沉默复合物，该复合物与靶mrna部分或完全互补，从而介导靶mrna的降解或翻译抑制，实现靶mrna的转录后沉默。mirna通过调控基因的转录后沉默，从而参与细胞的增殖和分化、机体的代谢、疾病发生等多种生物学过程。研究显示，48个mirna参与杜氏盐藻对高光和高盐的响应，并促进了β-胡萝卜素的积累。转录组分析显示83个mirna参与了雨生红球藻（haematococcus pluvialis）对高光的响应，促进了脂质和虾青素积累。以及通过人工mirna下调磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达，从而提高莱茵衣藻（chlamydomonas reinhardtii）的总脂肪酸产量。以上研究提示，mirna在微藻的环境响应和次级代谢物（如脂质）合成方面具有重要的调控作用。
8、现有技术中，野生型微拟球藻能合成epa，但产量较低。多种海洋微藻可以积累epa，微拟球藻是其中之一。然而使用f/2培养基培养未经遗传改造的微拟球藻（nannochloropsis oceanica ccmp1779/ccap 849/10），获得的epa仅占总脂肪酸的3%-5%，在生物量干重中的含量为40-50 mg/g，仅83-92 ng/10−6 cell。如果对未经遗传改造的微拟球藻进行大规模工业培养，则需要投入更多的设备成本以获得供应所需的产量。因此，为获得更高的epa产量，不适合对野生型微拟球藻直接进行大规模工业化培养。微藻来源的epa虽然是可再生资源，但面临全球供应方面的巨大缺口，仅依靠微藻的天然合成远远不足。虽然，现有技术优化培养工艺可提高epa产量，然而成本高昂，并可能造成环境污染。在不进行遗传改造的情况下，优化培养工艺是提高微拟球藻epa产量的策略之一，如改变光源（如使用led蓝光进行照明）、优化培养培养基成分（如改变f/2培养基中的nano3浓度或使用bg-11培养基）、改变培养方式（如进行异养培养）等均可提高微拟球藻的epa产量。然而，优化培养工艺需要投入更多的资金，比如使用特定波长的光源进行大规模培养，则需对灯源进行个性化定制，这加大了资金成本；或者以葡萄糖为碳源进行大规模培养，葡萄糖的用量也增加了成本。此外，通过在培养基中添加重金属以提高epa产量的培养工艺不仅会对环境造成严重污染，重金属可能会进入到人体中造成重金属中毒。综上所述，通过优化培养工艺以提高epa产量的方式成本高，并且可能造成环境污染。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了mir1858在制备和/或生产二十碳五烯酸中的应用。本发明通过工程代谢改造，获得微拟球藻mir1858工程藻株，其积累epa的水平极高，并且不需要对培养工艺进行优化，降低了培养成本。不同于以往提高epa的工程代谢手段，本发明从非编码水平进行遗传改造，获得的工程藻株能够高效稳定地积累epa。以本发明的mir1858工程藻株生产的epa具有绿色、环保、健康等特点，并且以该工程藻株进行epa的生产不具环境污染性，也不会破坏生态系统，适合大规模培养，因此该工程藻株是商业化生产epa的潜在工程藻株。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了mir1858在制备和/或生产二十碳五烯酸中的应用；所述mir1858具有：如seq id no:1所示的核苷酸序列。
4、本发明还提供了过表达mir1858在制备和/或生产二十碳五烯酸中的应用；所述mir1858具有：如seq id no:1所示的核苷酸序列。
5、本发明还提供了表达盒，包括：上述应用中的所述mir1858、抗性基因以及可接受的基因元件；所述抗性基因包括：博来霉素。
6、本发明还提供了质粒，包括：上述表达盒。
7、本发明还提供了宿主，将上述质粒转化和/或转染至底盘藻株。
8、在本发明的一些实施方案中，上述宿主中，所述底盘藻株包括：微拟球藻。
9、本发明还提供了上述表达盒、上述质粒和/或上述宿主在制备和/或生产二十碳五烯酸中的应用。
10、本发明还提供了上述表达盒、上述质粒和/或上述宿主在提高二十碳五烯酸的产量中的应用。
11、对微拟球藻（nannochloropsis oceanica ccmp1779）进行氮限制处理以提高其脂质含量，该藻株购买于美国国家海洋藻类和微生物中心（national center for marinealgae and microbiota, usa），并利用高通量测序和生物信息学进行组学关联分析，发现mir1858参与脂质的合成调控，其潜在预测靶点为accase2、lc-facs、lpaat、dgat2。通过遗传改造，对mir1858进行过表达，其过表达引起了硬脂酰辅酶a去饱和酶（δ-9 desaturase）和omega-6 脂肪酸去饱和酶（δ-12 desaturase）的表达上调。因此，在生物学功能上促进了饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转化，从而促进了不饱和脂肪酸的合成。通过气相色谱-质谱（gc-ms）联用分析，发现过表达mir1858使得微藻脂肪酸成分发生变化，饱和脂肪酸含量显著降低，而不饱和脂肪酸含量显著升高。在mir1858-1和mir1858-2两株工程藻株中，epa的相对含量分别比野生型增加了5.5倍和4.5倍；epa在生物量干重中的绝对含量分别达到159.6±3.5 mg/g和143.3±2.6 mg/g，而野生型中只有36.0±1.6 mg/g；在单位培养物中epa的产量分别达到32.3±1.2 mg/l和29.2±0.4 mg/l，而野生型只有7.5±0.2 mg/l。以上结果显示，mir1858工程藻株可高效合成epa，为大规模生产提供了可能。
12、本发明提供了mir1858在制备和/或生产二十碳五烯酸中的应用。
13、本发明的有益效果包括：
14、（1）、本发明研发一种工程微藻，可以高效合成二十碳五烯酸（epa），具有高效率、绿色、环保等特点。
15、（2）、本发明利用海洋微拟球藻工程菌株高效合成epa，生产不受自然水域限制，受环境影响小，并可进行人工大规模培养。
16、（3）、本发明利用优化后的工程微藻生产高附加值的epa，实现其高水平生产，填补当前供应不足的缺口。
17、（4）、利用本发明生产epa，具有低能耗和高产量的特点，可广泛应用于医药、食品和化妆品等行业。
1.mir1858在制备和/或生产二十碳五烯酸中的应用；
2.过表达mir1858在制备和/或生产二十碳五烯酸中的应用；
3.表达盒，其特征在于，包括：如权利要求1或2所述应用中的所述mir1858、抗性基因以及可接受的基因元件；所述抗性基因包括：博来霉素。
4.质粒，其特征在于，包括：如权利要求3所述的表达盒。
5.宿主，其特征在于，将如权利要求4所述的质粒转化和/或转染至底盘藻株。
6.如权利要求5所述的宿主，其特征在于，所述底盘藻株包括：微拟球藻。
7.如权利要求3所述的表达盒、如权利要求4所述的质粒和/或如权利要求5或6所述的宿主在制备和/或生产二十碳五烯酸中的应用。
8.如权利要求3所述的表达盒、如权利要求4所述的质粒和/或如权利要求5或6所述的宿主在提高二十碳五烯酸的产量中的应用。
