本申请涉及自然杀伤细胞生产，具体而言，涉及一种扩增生产自然杀伤细胞的方法。
背景技术：
1、自然杀伤细胞(nk细胞)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。nk细胞在临床和组织工程等领域中具有良好的应用前景，而临床和组织工程应用往往需要使用较大数量级(例如，1010-1011数量级)的nk细胞。
2、由于nk细胞的培养难度较大，目前，生产nk细胞主要是在实验室使用培养瓶进行扩增培养，不但导致培养瓶等耗材的消耗量大，而且生产效率低、人工成本高；此外，实验室规模的nk细胞扩增培养的污染概率高。
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种扩增生产自然杀伤细胞的方法，其旨在改善现有的生产自然杀伤细胞的扩增效率低的技术问题。
2、本申请提供了一种扩增生产自然杀伤细胞的方法，扩增生产自然杀伤细胞的方法包括：将自然杀伤细胞接种于生物反应器内进行扩增培养，获取扩增培养后的自然杀伤细胞；且在扩增培养的过程中，向生物反应器内加入预处理液；扩增培养为封闭式培养。预处理液为第一处理液或/和第二处理液。第一处理液的制备方法包括：将血样和生理盐水混合后于1000～1200r/min下进行第一离心；将第一离心后的沉淀物和生理盐水混合后，孵育2～3天；将孵育后的体系于1200～1400r/min下进行第二离心；对第二离心后的上清液依次进行第一过滤、第一浓缩脱盐和第一冷冻干燥，将第一冷冻干燥后的体系与无菌水混合；其中，血样为外周血或脐带血。第二处理液的制备方法包括：对扩增培养后的体系中的上清液依次进行第二过滤、第二浓缩脱盐和第二冷冻干燥，将第二冷冻干燥后的体系与无菌水混合。
3、本申请提供的扩增生产自然杀伤细胞的方法可在短时间内获取大量的自然杀伤细胞，操作简单、工作强度低、扩增效率高、生产规模可灵活改变；且在扩增培养的过程中使用特定的第一处理液或/和第二处理液，可提高扩增生产获取的自然杀伤细胞的纯度；此外，对本申请扩增培养后的体系中上清液进行特定处理得到的第二处理液可以继续用于后续扩增生产自然杀伤细胞，可节约成本；第二处理液中，细胞因子ifn-γ的含量表达较为丰富，可以将第二处理液用于生产获取细胞因子ifn-γ，并将获取的细胞因子ifn-γ应用于临床医学上作为制备治疗ⅱ型糖尿病的药物前体以及缓解ⅱ型糖尿病患者免疫功能障碍的试剂等。
4、在本申请可选的实施方式中，血样的体积为30～50ml；或/和，第一离心和第二离心的时间各自独立地为4～6min；或/和，第一过滤、第一浓缩脱盐、第二过滤以及第二浓缩脱盐的压力和温度分别各自独立地为0.3～0.6mpa以及2～8℃；或/和，第一过滤和第二过滤均采用孔径依次减小的多次过滤，第一过滤和第二过滤的最小孔径为15～25μm；或/和，第一冷冻干燥和第二冷冻干燥的温度和时间分别各自独立地为-40～-60℃以及3～6h。
5、在本申请可选的实施方式中，血样中含有青链霉素，且青链霉素在血样中的终浓度为80～120u/ml。
6、在本申请可选的实施方式中，在扩增培养的过程中，采用流加补料的方式向生物反应器内加入预处理液。
7、上述技术方案，有利于避免扩增培养过程中的污染风险，也可提高扩增生产获取的自然杀伤细胞的纯度。
8、可选地，采用多次流加补料的方式向生物反应器内加入预处理液。
9、可选地，每次流加补料时，向生物反应器内加入预处理液的体积为25～35ml；其中，第一处理液中，第一冷冻干燥后的体系与无菌水的体积比为1:(2～4)；第二处理液中，第二冷冻干燥后的体系与无菌水的体积比为1:(2～4)。
10、在本申请可选的实施方式中，在扩增培养的过程中，向生物反应器内加入扩增培养液；扩增培养液中含有自体血清、庆大霉素以及基础培养基。
11、上述技术方案，可促进自然杀伤细胞的繁殖和生长。
12、可选地，扩增培养液的制备方法包括：将体积比为(15～25):(0.8～1.2)的基础培养基与自体血清溶液混合；其中，基础培养基中含有庆大霉素，且庆大霉素在基础培养基中的浓度为600～1000u/ml；自体血清在自体血清溶液中的质量分数为1～5％。
13、可选地，采用流加补料的方式向生物反应器内加入扩增培养液。
14、可选地，采用多次流加补料的方式向生物反应器内加入扩增培养液。
15、可选地，在扩增培养的第2～4天以及第5～7天向生物反应器内加入扩增培养液。
16、可选地，流加补料的碳源含量为0.5～5g/l。
17、在本申请可选的实施方式中，生物反应器为bioflo 110型生物反应器。
18、在本申请可选的实施方式中，扩增培养的时间为4～30天。
19、上述技术方案，有利于自然杀伤细胞在生物反应器内高密度繁殖生长。
20、在本申请可选的实施方式中，接种于生物反应器内的自然杀伤细胞的获取方法包括：将含有诱导培养液、单个核细胞以及预处理液的细胞体系接种于培养袋中进行诱导培养；其中，单个核细胞包括外周血单个核细胞或脐带血单个核细胞。
21、上述技术方案，可诱导培养获得待接种于生物反应器内的自然杀伤细胞。
22、在本申请可选的实施方式中，诱导培养的时间为2～7天；或，当培养袋内的细胞数量达到培养袋内起始细胞数量的3～20倍后，结束诱导培养。
23、可选地，培养袋的容量为500～2000ml。
24、在本申请可选的实施方式中，细胞体系的制备方法包括：向诱导培养液中加入细胞液和预处理液。细胞液中单个核细胞的细胞密度为1×106～1.5×106个/ml。第一处理液中，第一冷冻干燥后的体系与无菌水的体积比为1:(2～4)；第二处理液中，第二冷冻干燥后的体系与无菌水的体积比为1:(2～4)；且细胞液与预处理液的体积比为(20～25):(1～2)。
25、可选地，诱导培养液中含有自体血清、庆大霉素以及基础培养基。
26、可选地，诱导培养液的制备方法包括：将体积比为(15～25):(0.8～1.2)的基础培养基与自体血清溶液混合；其中，基础培养基中含有庆大霉素，且庆大霉素在基础培养基中的浓度为600～1000u/ml；自体血清在自体血清溶液中的质量分数为1～5％。
1.一种扩增生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的扩增生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述血样的体积为30～50ml；
3.根据权利要求1所述的扩增生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述血样中含有青链霉素，且所述青链霉素在所述血样中的终浓度为80～120u/ml。
4.根据权利要求1所述的扩增生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，在所述扩增培养的过程中，采用流加补料的方式向所述生物反应器内加入所述预处理液；
5.根据权利要求1～4中任一项所述的扩增生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，在所述扩增培养的过程中，向所述生物反应器内加入扩增培养液；所述扩增培养液中含有自体血清、庆大霉素以及基础培养基；
6.根据权利要求1～4中任一项所述的扩增生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述生物反应器为bioflo 110型生物反应器。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的扩增生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述扩增培养的时间为4～30天。
8.根据权利要求1～4中任一项所述的扩增生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，接种于所述生物反应器内的所述自然杀伤细胞的获取方法包括：将含有诱导培养液、单个核细胞以及所述预处理液的细胞体系接种于培养袋中进行诱导培养；
9.根据权利要求8所述的扩增生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述诱导培养的时间为2～7天；
10.根据权利要求8所述的扩增生产自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述细胞体系的制备方法包括：向所述诱导培养液中加入细胞液和所述预处理液；
