本发明涉及基因工程，具体涉及一种酯酶全细胞催化剂及其制备和应用。
背景技术：
1、第一菊酸(英文名称chrysanthemic acid)（2，2，3，3-四甲基环丙烷羧酸）作为一种重要的农药中间体，它的环丙烷环上存在两个手性碳原子，因此存在左右旋两种构型，加上顺反两种异构体，第一菊酸共有四种异构体。作为拟除虫菊酷农药的酸部组成，不同异构体的菊酸，其杀虫活性差异较大，其中右旋的反式第一菊酸((+)-trans-ca)表现出较高的生物活性，是合成甲氰菊酯等农药的重要中间体。以往的报道中，化学法和酶法拆分外消旋酯或者酸是合成光学纯菊酸的重要方法。目前工业化生产上主要有重氮乙酸酯法(又称harper和campbell法)和异戊烯基砜法(又称martel法)。用上述方法得到的菊酸乙酯(甲酯)在碱存在的醇溶液中水解，再酸化得到菊酸。生产过程中会使用大量酸碱及有机试剂，造成环境污染，经济价值低。
2、目前生物法合成右旋反式菊酸的已有相关研究，其中masako等人报道的一种来自于arthrobacter globiformis 的酯酶基因，立体选择性水解效率在底物浓度高达40%时仍有效，通过超滤去除产生的菊酸。所生成的(+)-反式菊酸光学纯度为100%.但是存在一定程度的产物抑制，导致反应过程中需要进行多次超滤分离出产物后再进行反应，存在反应条件复杂，纯化成本高等缺点。
3、因此，针对外消旋第一菊酸的拆分，迫切需要一种高催化活性和高产物耐受性的生物催化剂，以满足工业化生产的需求。有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明是为了克服现有技术中，存在应用于拆分菊酸甲酯的升温催化剂的催化活性低和产物耐受性差的问题，相较于传统酶催化，全细胞催化有更高的稳定性和重复使用性，因此本发明提供了一种可以表达羧酸酯酶突变体的酯酶全细胞催化剂及其制备和应用以克服上述缺陷。
2、为实现上述发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：
3、第一方面，本发明公开了一种羧酸酯酶突变体，所述羧酸酯酶突变体在seq idno.1所示氨基酸序列上发生如下突变：第236位甘氨酸替换为缬氨酸，第417位精氨酸替换为苯丙氨酸，第545位苏氨酸替换为丙氨酸，所述羧酸酯酶突变体的氨基酸序列如seq idno.2所示。通过选择上述点位进行突变，所得到的羧酸酯酶产物抑制较低，可以解决现有技术中用于拆分菊酸甲酯的升温催化剂的催化活性低和产物耐受性差的问题。
4、针对现有技术和方法的不足和工业化生产的实际需求，本发明从众多微生物来源的酶中进行了筛选，最终确定了来源于bacillus licheniformis的适合工业生产的可用于进行酶工程改造的羧酸酯酶基因（est1，genebank：u35855.1），并以此为出发菌株，对其进行酶工程改造，以提高其酶活性用于的催化合成，旨在解决现有技术中的各种问题。在经过初期的突变筛选后，得到了一些酶活较出发菌株提高了的突变型菌株，其中有一个突变型菌株的酶活是出发菌株的3.4倍，应用该突变菌株合成右旋反式菊酸(+)-trans-ca，在反应48 h后，最高产量为98.2g/l。
5、本发明提供的羧酸酯酶突变体，在如seq id no.1所示的氨基酸序列上，选择位点r417、g236、t545作为进行改造的位点，得到羧酸酯酶突变体est-g236v/r417f/t545a（est-m3），显著提高了其在高产物浓度下选择性拆分菊酸甲酯制备右旋反式菊酸的活性，光学纯度可达99.2%以上。得到的羧酸酯酶突变体可在细胞上清中可溶性表达，可通过微生物发酵进行大规模生产，反应条件温和，操作过程简便，更适用于工业生产。
6、第二方面，本发明还公开了一种能够编码上述羧酸酯酶突变体的多核苷酸，该多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.3所示。其中，“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于单链、双链或多链dna或rna、基因组dna、cdna、dna-rna杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸编码上述t7rna聚合酶突变体，编码可选地为编码正义链或反义链。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。术语“多核苷酸”和“核酸”在本说明书中可互换地使用。
7、第三方面，本发明还公开了一种携带如seq id no.3所示核苷酸序列的重组载体。所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、菌粒、柯斯质粒或人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如入噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(ires)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚u列等)。在本发明中，优选地，所述重组载体为pet28a(+)、pet21a(+)或pet21b(+)。
8、进一步的，所述重组载体含有t7启动子。t7启动子是一种较弱的启动子，便于筛选活性较高的羧酸酯酶突变体，且不会因为过高的转录水平影响增加胞内酶的活性。
9、第四方面，本发明还公开了一种酯酶全细胞催化剂，所述酯酶全细胞催化剂为能够表达本发明第一方面所述的羧酸酯酶突变体的重组细胞。其中，所述细胞可以指单个细胞，也可以指细胞系，或细胞培养物。本文中细胞包括其后代，后代可以由于天然的、偶然的或故意的突变不一定与原代细胞完全相同，在形态学上和/或在基因组dna上与原代细胞存在差异。所述细胞可以为天然细胞或转化体。
10、进一步的，所述重组细胞携带如seq id no.2所示的核苷酸序列，或携带本发明第三方面所述的重组载体以及含有t7启动子的上述重组载体。
11、第五方面，本发明还公开了一种构建上述重组细胞的方法，包括：将上述重组载体转化至宿主菌中，得到重组细胞。所述宿主菌优选为大肠杆菌，如本领域常见用作基因工程宿主的ecoliw3110、e coli w3110、e coli bl21、e.coli bw25113等模式菌株，只要可以对其进行基因编辑表达上述需要过表达或异源过表的基因即可。但所述宿主菌并不限于大肠杆菌，可根据具体情况选择其他合适的宿主菌种类，如枯草芽孢杆菌或者酿酒酵母等。
12、第六方面，本发明还公开了一种酯酶全细胞催化剂在制备右旋反式菊酸中的应用。本发明公开的羧酸酯酶突变体一步催化底物菊酸甲酯转化为右旋反式菊酸反应，如图2所示。
13、第七方面，本发明还公开了一种右旋反式菊酸的制备方法，包括以下步骤：
14、（1）将本发明公开的酯酶全细胞催化剂、缓冲液和外消旋菊酸甲酯混合均匀，进行催化反应；
15、（2）反应产物经纯化得到右旋反式菊酸。
16、在一些具体的实施例中，所述催化反应的温度为40~55℃，优选为45~50℃；
17、所述催化反应的时间为1~6h，优选为3~6h；
18、所述催化反应的ph为6~9，优选ph为6~8；
19、优选地，所述外消旋菊酸甲酯的质量浓度为50g/l~140g/l，优选为100g/l~140g/l；
20、优选地，所述羧酸酯酶突变体的用量为1g/l~20g/l，优选为5g/l~10g/l；
21、优选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、tris-hci或na0h-甘氨酸溶液；
22、优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
23、优选地，所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度为30mm~100mm。
24、因此，本发明具有以下有益效果：
25、（1）本发明通过在如seq id no.1所示的氨基酸序列上，选择突变位点作为进行改造的位点，得到羧酸酯酶突变体，有效解决现有技术中存在应用于拆分菊酸甲酯的升温催化剂的催化活性低和产物耐受性差的问题。
26、（2）本发明的羧酸酯酶突变体，显著提高了其选择性拆分菊酸甲酯制备右旋反式菊酸的活性，光学纯度可达99%以上。
27、（3）本发明的羧酸酯酶突变体可在细胞上清中可溶性表达，可通过微生物发酵进行大规模生产，反应条件温和，操作过程简便，更适用于工业生产。
1. 一种羧酸酯酶突变体，其特征在于，所述羧酸酯酶突变体在seq id no.1所示氨基酸序列上发生如下突变：第236位甘氨酸替换为缬氨酸，第417位精氨酸替换为苯丙氨酸，第545位苏氨酸替换为丙氨酸，所述羧酸酯酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2. 一种编码如权利要求1所述的羧酸酯酶突变体的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.3所示。
3.一种携带如权利要求2所述核苷酸序列的重组载体。
4.根据权利要求3所述的一种重组载体，其特征在于：所述重组载体含有t7启动子。
5.一种酯酶全细胞催化剂，其特征在于：所述酯酶全细胞催化剂为能够表达如权利要求1所述的羧酸酯酶突变体的重组细胞。
6. 根据权利要求5所述的一种酯酶全细胞催化剂，其特征在于：所述重组细胞携带如seq id no.2所示的核苷酸序列，或携带如权利要求3或4所述的重组载体。
7.一种重组细胞的构建方法，其特征在于：将如权利要求3或4所述的重组载体转化至宿主菌中，得到重组细胞。
8.一种如权利要求5所述的一种酯酶全细胞催化剂在制备右旋反式菊酸中的应用。
9.一种右旋反式菊酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
