本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及催化肽键合成的肽键合成酶及其应用。
背景技术：
1、肽键是一种特殊形式的酰胺键(-co-nh-)，由两个氨基酸分子之间的α-氨基和α-羧基通过脱水缩合反应形成。作为多肽和蛋白质结构的基础，肽键合成受到广泛的关注。由于氨基酸间的羧基-氨基脱水缩合的高反应能垒以及水的动力学抑制，体外合成肽键是极其困难的，特别是在纯水相体系中，目前没有催化剂可以催化天然氨基酸间“一步脱水缩合”形成肽键。
2、在化学偶联中采用羧基的预活化来克服高反应能垒和水的动力学抑制，正如固相多肽合成法(spps)和天然化学连接法(ncl)。然而，羧基预活化和氨基酸侧链基团保护、去保护造成的多步反应，以及危险化学试剂的使用，是化学偶联法的重大缺陷。
3、核糖体是目前唯一已知的介导天然氨基酸缩合肽键的过程。但这一反应过程是由60-80个蛋白质协同作用，过程复杂且受到严格条件控制，几乎不具应用扩展性。
4、发掘或设计一种单酶实现类核糖体的天然氨基酸间“一步脱水缩合”功能，将为生命、医药、化工、材料等行业带来巨大的变革和无穷的应用想象空间。这不仅可以彻底改变目前多肽和蛋白质合成产业；还可在活细胞表面进行生物素化、peg等特异性修饰或标记，揭示细胞凋亡、炎症、细菌和病毒感染等复杂的生物学过程；通过特异性识别靶细胞表面受体实现药物的靶向输送，显著提高药物靶向性和生物有效性。
5、目前，li等人发现一种胞内脂肪酶可以在20％水中催化羧基-氨基脱水缩合合成酰胺小分子，应用范围受限。科学家们也基于patg、butelase 1、sortase a和trypsin蛋白酶理性设计获得的肽连接酶，由于需要识别特定的底物序列切割肽键暴露出羧基后再与氨基底物合成肽键，非一步合成反应，应用范围受限。subtiligase是由wells等人通过动力学控制对subtilisin(一种丝氨酸蛋白酶)改造而来的肽连接酶，可催化经酯化修饰的酯基与氨基合成肽键，并将其广泛应用在肽的连接、环化、多肽药物合成、蛋白质合成、模块化生物偶连(weeks am,wells ja.subtiligase-catalyzed peptide ligation.chemrev.2020mar 25；120(6):3127-3160.doi:10.1021/acs.chemrev.9b00372.epub 2019oct30.pmid:31663725.)、蛋白质n端修饰和细胞n端组学鉴定(schaefer k,lui i,byrnes jr,kang e,zhou j,weeks am,wells ja.direct identification of proteolyticcleavages on living cells using a glycan-tethered peptide ligase.acs centsci.2022oct26；8(10):1447-1456.doi:10.1021/acscentsci.2c00899.epub 2022oct11.pmid:36313159；pmcid:pmc9615116.)等领域，展示了巨大的价值与意义。但遗憾的是，以上所有的酶制剂需要有机相催化、底物识别或修饰，这将会限制其在生理反应条件下活细胞体系中的进一步应用。
6、因此，进一步对subtilisin进行改造，开发一种纯水相中一步法催化肽键合成的肽键合成酶，是本领域技术人员致力于研发的方向之一。
技术实现思路
1、为了解决上述现有技术问题，本发明基于对野生型枯草芽孢杆菌蛋白酶subtilisin的研究，提供了能够在纯水相环境中一步法催化肽键合成的枯草芽孢杆菌蛋白酶突变体，可以实现在纯水相环境中一步催化天然氨基酸合成肽键，绿色合成，提供一种新的肽键合成技术思路，满足肽合成的工业生产需求。
2、本发明的目的是这样实现的：
3、本发明提供了一种能够在纯水相环境中一步法催化肽键合成的枯草芽孢杆菌蛋白酶突变体，其氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seqid no.5、seq id no.6中的一种所示。
4、编码上述能够在纯水相环境中一步法催化肽键合成的枯草芽孢杆菌蛋白酶突变体的基因。
5、本发明还提供了一种重组载体，包含如seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12中的一种所示的核苷酸序列。
6、还提供了一种宿主细胞，其包含上述重组载体。
7、还提供了一种上述能够在纯水相环境中一步法催化肽键合成的枯草芽孢杆菌蛋白酶突变体在制备多肽产品中的应用。
8、本发明通过半理性设计突变点，得到本发明肽键合成酶突变体m1、m2、m3、m4、m5、4m，即分别为将野生型subtilisin第62位天冬酰胺变为苯丙氨酸、第63位的丝氨酸变为缬氨酸、第225位的脯氨酸突变为丙氨酸；将野生型subtilisin第62位天冬酰胺变为苯丙氨酸、第63位的丝氨酸变为亮氨酸、第225位的脯氨酸突变为丙氨酸；将野生型subtilisin第62位天冬酰胺变为缬氨酸、第63位的丝氨酸变为亮氨酸、第225位的脯氨酸突变为丙氨酸；将野生型subtilisin第62位天冬酰胺变为苯丙氨酸、第63位的丝氨酸变为异亮氨酸、第225位的脯氨酸突变为丙氨酸；将野生型subtilisin第217位的酪氨酸变为亮氨酸、第218位的天冬酰胺变为苯丙氨酸、第225位的脯氨酸突变为丙氨酸；将野生型subtilisin第62位天冬酰胺变为亮氨酸、第63位的丝氨酸变为亮氨酸、217位的酪氨酸变为亮氨酸、第218位的天冬酰胺变为苯丙氨酸、第225位的脯氨酸突变为丙氨酸。
9、发明人通过对野生型subtilisin的结构分析，提供了第62位、第63位、第217位、第218位、第225位关键突变位点，并对突变位点进行不同的组合，得到本发明能够在纯水相环境中一步法催化肽键合成的枯草芽孢杆菌蛋白酶突变体。结果表明，本发明枯草芽孢杆菌蛋白酶突变体在肽键合成中的应用与现有技术相比，可以实现在纯水相环境中一步法催化天然氨基酸合成肽键，满足肽合成的工业生产需求，省去了现有技术需要有机相催化或底物识别或修饰步骤，解决了现有肽键合成受环境限制等问题，具有更好的应用前景。
1.一种能够在纯水相环境中一步法催化肽键合成的枯草芽孢杆菌蛋白酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq idno.5、seq id no.6中的一种所示。
2.编码权利要求1所述的能够在纯水相环境中一步法催化肽键合成的枯草芽孢杆菌蛋白酶突变体的基因。
3.一种重组载体，其特征在于，其包含如seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seqid no.10、seq id no.11、seq id no.12中的一种所示的核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求3所述重组载体。
5.权利要求1所述的能够在纯水相环境中一步法催化肽键合成的枯草芽孢杆菌蛋白酶突变体在制备多肽产品中的应用。
