本发明属于生物医药，具体涉及一种耐药细胞株及其应用。
背景技术：
1、非小细胞肺癌(nsclc)是最常见的肺癌类型，约占所有肺癌病例的85％。表皮生长因子受体(egfr)是nsclc的重要驱动基因，egfr激活突变在nsclc患者中的发生率约为10-35％。egfr酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tki)已成为治疗egfr突变阳性nsclc患者的标准一线治疗方案，显著延长了患者的无进展生存期和总生存期。
2、然而，尽管egfr-tki初始疗效显著，绝大多数患者在接受治疗10-14个月后会出现获得性耐药，导致疾病进展。其中，约50％的耐药是由egfr 20外显子t790m突变引起的。为了克服t790m介导的耐药，第三代不可逆egfr-tki如奥希替尼(osimertinib，azd9291)应运而生。奥希替尼可有效抑制egfr敏感突变和t790m耐药突变，使t790m阳性nscl c患者的疾病控制率达到80％以上。
3、尽管奥希替尼可有效克服t790m介导的耐药，遗憾的是，它同样面临获得性耐药的问题。临床上，约有20-40％的患者在接受奥希替尼治疗后出现耐药。因此，深入研究奥希替尼获得性耐药机制并建立相应的细胞模型，对于克服耐药和指导临床用药具有重要意义。
4、目前，国内外学者利用不同的nsclc细胞系构建了多种奥希替尼耐药细胞模型，如pc-9/azdr、h1975/azdr等。这些模型在一定程度上模拟了患者体内的耐药过程，为研究耐药机制提供了重要工具。然而，现有的耐药细胞模型仍存在一些局限性：(1)耐药细胞株的构建周期较长，通常需要数月至数年，耗时耗力。(2)不同研究使用的细胞系和诱导方法不尽相同，导致所获得的耐药细胞株的特性存在较大差异，缺乏可比性。(3)现有模型多基于细胞系构建，与患者体内的肿瘤微环境差异较大，具有一定的局限性。(4)对于获得性耐药的分子机制，不同模型得出的结论不尽一致，还需要进一步的验证和统一。
技术实现思路
1、1、要解决的问题
2、针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种耐药细胞株及其应用，通过优化药物浓度和培养条件，显著缩短耐药细胞株的构建时间，提高耐药细胞株构建的成功率和稳定性，并结合高通量测序等技术，旨在更全面、深入地揭示azd9291耐药的分子机制，为临床上预测azd9291耐药风险和指导个体化治疗提供科学依据。
3、2、技术方案
4、为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
5、一种耐药细胞株，保藏号为gdmcc no：63812，其保藏中心为广东省微生物菌种保藏中心，其保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏日期为2024年2月28日。此外，所述的耐药细胞株的分类学名称为人肺腺癌细胞耐药株pc9-ar。所述的耐药细菌株包括三个及以上突变位点，至少包括如下kiaa1549-braf、braf-dennd2a、chch d3-braf三个突变位点。
6、其中耐药细胞株的构建方法，包括如下步骤：
7、(1)细胞复苏：将冻存的细胞转移至含细胞培养基的离心管中，离心后弃去上清液，用细胞培养基重悬细胞，接种于含细胞培养基的培养皿中复苏培养；
8、(2)细胞传代：将步骤(1)中复苏培养后的细胞，加入消化酶进行消化，吹打混匀，并补充新的细胞培养基进行传代培养；
9、(3)药物筛选与耐药性诱导：将步骤(2)中传代培养后处于对数生长期的细胞，转移至新的细胞培养基进行培养，同时检测细胞的增殖抑制率，并通过比较ic50值来判定细胞是否实现高度耐药，直至筛选出高耐药性诱导的细胞。
10、优选的，步骤(1)中冻存的细胞为表皮生长因子受体突变的非小细胞肺癌细胞系pc-9；
11、步骤(1)中细胞培养基为含有灭活胎牛血清、双抗及奥希替尼的dmem培养基，其中灭活胎牛血清的质量百分比为5-15％，其中双抗为质量比1：(1-8)的青霉素与链霉素，其中双抗的质量百分比为0.5-1.5％，其中奥希替尼的质量浓度为1-5um。
12、优选的，步骤(1)中离心的参数如下：600-1200rpm离心2-10min；
13、步骤(1)中细胞培养的参数如下：30-40℃、质量浓度百分比2-10％co2；
14、步骤(1)中细胞培养后次日观察细胞形态、密度和存活率，吸去旧的细胞培养基，加入新的细胞培养基，并继续培养至细胞汇合度为60-90％。
15、优选的，步骤(2)中消化酶为脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶中的一种；
16、步骤(2)中消化的参数如下：静置30s-120s。
17、优选的，步骤(3)中细胞培养基的奥希替尼的浓度为50-200nm；
18、步骤(3)中检测细胞的增殖抑制率的方法如下：
19、将处于对数期的稀薄啊，使用质量百分比为0.20-0.30％的胰蛋白酶进行消化，制备单细胞悬液并计数，接着将细胞接种于96孔板中，设定不同浓度的奥希替尼孵育24-96h，加入mtt溶液，继续孵育2-6h后终止反应，使用dmso溶解结晶，测定od值。
20、优选的，步骤(3)中使用细胞培养基进行培养时，2-3d更换一次细胞培养基。
21、优选的，步骤(3)中直至筛选出高耐药性诱导的细胞的方法如下：取一部分细胞转移至不含药的细胞培养基中培养10-20d，再次使用mtt法检测ic50值，若ic50数值保持不下降，则构建成功。
22、优选的，步骤(3)中直至筛选出高耐药性诱导的细胞的方法还包括形态学观察、基因突变检测；其中形态学观察如下：使用倒置荧光显微镜观察耐药细胞株与亲本细胞的形态差异；
23、其中基因突变检测如下：采用高通量基因测序技术，检测耐药细胞株与亲本细胞的基因变异情况。
24、一种如上述所述的耐药细胞株在奥希替尼耐药中应用。
25、优选的，所述的耐药细胞株在构建人非小细胞肺癌体内外奥希替尼耐药的肿瘤模型中的应用。
26、3、有益效果
27、相比于现有技术，本发明的有益效果为：
28、(1)缩短构建周期：传统的耐药细胞株构建方法通常需要较长的时间，可能需要数月至数年。本发明通过优化药物暴露和培养条件，显著缩短了耐药细胞株的构建时间(耐药细胞株的构建通常需要数月或数年的时间。具体而言，低浓度的耐药株可能需要数年才能达到耐药标准，而中浓度的构建则可能需要几个月到数年不等。高浓度的处理往往会直接杀死细胞，导致无法继续进行耐药株的构建)，提高了实验效率。
29、(2)提高稳定性和成功率：现有技术中，不同实验室使用的细胞系和方法不一致，导致耐药细胞株的特性差异较大。本发明提供了一种标准化的构建方法，确保了耐药细胞株的稳定性和构建成功率。
30、(3)更好模拟临床条件：现有模型多基于细胞系构建，难以充分模拟患者体内的肿瘤微环境。本发明通过优化培养条件，使耐药细胞株更接近临床耐药情况，从而提高研究结果的临床相关性。
31、(4)提供可靠的药物筛选平台：本发明构建的耐药细胞株可用于筛选和评估新药或药物组合的疗效，为克服azd9291耐药提供了一个可靠的平台。
32、(5)深入揭示耐药机制：通过高通量测序等技术手段，本发明能够更全面地揭示azd9291耐药的分子机制，为未来的研究和治疗策略提供科学依据。
33、(6)临床应用潜力：本发明构建的耐药细胞株不仅在实验室研究中具有重要价值，还可以用于指导临床个体化治疗策略的制定，具有广泛的应用前景。
34、综上所述，本发明在耐药细胞株的构建效率、稳定性、临床模拟以及应用潜力方面均显著优于现有技术，提供了重要的科学和临床价值。
1.一种耐药细胞株，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的耐药细胞株，其特征在于：
3.一种如权利要求1-2任一项所述的耐药细胞株在奥希替尼耐药中应用。
4.根据权利要求3所述的耐药细胞株在构建人非小细胞肺癌体内外奥希替尼耐药的肿瘤模型中的应用。
