本发明涉及基因工程，具体涉及一种生产胶原细胞株的构建及其生产方法。
背景技术：
1、i型胶原蛋白(type i collagen，col1)是人体中含量最丰富的具有三螺旋结构的胶原蛋白之一，在维护皮肤健康和骨组织结构完整等方面发挥了重要作用。因此，重组人i型胶原(recombinant human col1，rhcol1)作为天然人胶原的替代物，在功能性生物材料、化妆品和食品等领域广泛应用。然而目前市面上的rhcol1产品均为片段胶原蛋白，且不具备三螺旋结构。
2、目前已有重组胶原蛋白均为大肠杆菌或酵母菌发酵得到，其不具备完整的哺乳动物细胞完整的胶原蛋白发酵表达体系，因此此类产物无高级结构。
3、完整胶原蛋白的合成过程：
4、(1)由信使核糖核酸(mrna)将编码胶原基因上的遗传信息转录到核糖体并翻译成对应的胶原氨基酸序列，从而合成前胶原链，并被分泌到内质网腔内；
5、(2)前胶原链的羟基化和糖基化修饰，三条前胶原链形成前胶原分子；
6、(3)分泌到细胞外的前胶原分子经酶的限制性剪切转变为原胶原分子，聚集形成胶原纤维，并在胶原分子间生成共价交联。
7、根据合成场所的不同，成纤维胶原的生物合成可分为细胞内和细胞外两个阶段，前期在细胞内进行，后期则在细胞外进行。此外，不同组织中的胶原由不同的细胞合成，如结缔组织中的胶原主要由成纤维细胞合成，软骨中的胶原由软骨细胞合成，骨中的胶原由成骨细胞合成，基底膜中的胶原则由上皮或内皮细胞合成。
8、成纤维胶原的生物合成涉及10种蛋白酶，其中包括3种羟化酶：脯氨酰4-羟化酶(prolyl 4-hydroxylase)、脯氨酰3-羟化酶(prolyl 3-hydroxylase)和赖氨酰羟化酶(1ysly-hydroxylase)；2种糖化酶：羟赖氨酰半乳糖基转移酶(hydroxylysylgalactosyl-transferase)和羟赖氨酰葡萄糖基转移酶(hydroxylysyl glucosyl-transferase)；2种异构酶：肽脯氨顺反异构酶(prolyl-peptidyl cis/trans isomerase)和蛋白质二硫键异构酶(protein disulphide isomerase)；2种前肽剪切酶：n端前肽酶和c端前肽酶；以及1种氧化酶：赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase)。
9、基于携带遗传基因信息的mrna在核糖体上合成的多肽链，实际上是比通常所谓的胶原a链更大的多肽链，称为前胶原a链，其合成过程从氨基端向梭基端进行。前胶原a链包括6个区域，从n端向c端依次为信号肽、n端前肽、n端肽、三股螺旋区域、c端肽和c端前肽。其中，信号肽与前胶原a链在内质网腔内的迁移有关，一般由20-40个氨基酸残基构成。当信号肽被切掉后，前胶原a链即进入内质网腔内。
10、胶原分子中特有的羟脯氨酸和羟赖氨酸并无遗传密码和反密码，而是前胶原a链中的脯氨酸、赖氨酸残基经羟基化而成，该反应由脯氨酰4-羟化酶、脯氨酰3-羟化酶和赖氨酰羟化酶在内质网中催化完成。这3种酶都需要fe2+、和维生素c作为辅助因子，a-酮戊二酸作辅助底物，因此缺氧或缺乏维生素c都会影响羟化酶的活性，如临床上缺氧会使伤口、溃疡等愈合延迟，缺乏维生素c则导致不能合成正常的胶原纤维，出现皮肤结节、血管脆弱及伤口愈合缓慢等症状(5)；此外，当存在三股螺旋底物时羟化酶会失活，因此羟基化修饰必须在前胶原分子形成之前完成。
11、羟基化作用对胶原三股螺旋结构的稳定性十分重要，这是因为羟脯氨酸有利于在前胶原a链之间生成氢键，以促使前胶原三股螺旋的形成，而羟基化不足的a链在体温下不能形成三股螺旋，因而不能以前胶原分子的形式分泌到细胞外。每条前胶原a链中有将近100个脯氨酸残基被羟基化为4-羟脯氨酸，而大约10个赖氨酸残基转化为羟赖氨酸。值得一提的是，胶原中的羟脯氨酸含量可作为胶原热稳定性的评判指标，其含量越高，胶原的热稳定性就越高。一般而言，哺乳动物胶原中的羟脯氨酸含量高于水产动物胶原，相应地，哺乳动物胶原的热稳定性优于水产动物胶原的热稳定性。
12、糖基化作用发生在前胶原a链三股螺旋区域的羟赖氨酸和c端前肽的天冬酰胺，半乳糖或葡萄糖-半乳糖通过o-糖昔键连接到羟赖氨酸的羟基上，而富含甘露糖的寡糖链则以n-糖昔键与天冬酰胺结合。不同组织中胶原分子所含共价连接的糖基为0.4％-12％，主要包括葡萄糖、半乳糖以及它们的双糖，这些糖基主要由尿昔二磷酸半乳糖和尿昔二磷酸葡萄糖提供(5)。在内质网中，糖基由羟赖氨酰半乳糖基转移酶和羟赖氨酰葡萄糖基转移酶催化连接至5-羟赖氨酸残基上，一般先转移半乳糖，再转移葡萄糖。糖化酶的活性在各种胶原组织中随着动物年龄的增长而降低，与组织中胶原合成的程度有关。研究表明，糖基位于胶原纤维中原胶原分子的接头处，因此糖基化可能与胶原纤维的定向排列有关，但是糖基化修饰的作用目前尚不完全清楚。
13、当3条前胶原a链获得足够数量的羟脯氨酸后，前胶原a链通过其球形c末端多肽相互靠近并以二硫键连接而形成三股螺旋核心，随后，前胶原三股螺旋从c末端逐渐向n末端延伸生成，形成的前胶原分子通过细胞微管系统被分泌到细胞外。
14、在细胞外，前胶原分子在n端前肽酶和c端前肽酶的作用下，分别切除n端前肽和c端前肽，从而形成原胶原分子。前胶原分子转化为原胶原分子后，溶解性降低约为原有的1/1000，原胶原分子在生理条件下可通过分子间的电荷相互吸引而组装成纤维，但最初形成的纤维并不稳定，须经共价交联使之进一步固定。
15、虽然重组胶原近年来国内不断有新的产品上市，但均存在以下缺点：(1)全部是重组片段化胶原分子；(2)不具有空间三螺旋结构；(3)不具有体外自组装功能；(4)大肠杆菌、酵母或烟草表达系统较为常见，未见用哺乳动物细胞表达系统
16、中国专利cn101065491b提供了在植物中生产胶原的方法和生产胶原的植物。该方法通过以能够使胶原a链积聚在缺乏内源性p4h活性的亚细胞区室中的方式，在植物中表达至少一种类型的胶原a链来实现，从而在植物中生产胶原。但是，该植物表达系统的产量不高，且表达得到的胶原成分与天然胶原有一定的区别，应用面受限。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提出一种生产胶原细胞株的构建及其生产方法，通过基因工程技术，通过对底盘cho细胞进行针对性的模块化改造，构建并筛选高产rhcol1的细胞株，同时开发cho发酵培养和纯化工艺，实现全长且具有稳定三螺旋结构的rhcol1重组表达，实验具有空间三螺旋结构的、体外可自组装的、与天然人胶原氨基酸序列完全相同的全长胶原的重组表达。
2、本发明的技术方案是这样实现的：
3、本发明提供一种生产胶原细胞株的构建方法，包括以下步骤：
4、s1.底盘细胞株的改造；
5、s2.构建胶原表达系统；
6、s3.高通量筛选高产单克隆细胞株。
7、作为本发明的进一步改进，步骤s1的具体方法如下：
8、s101.利用基因编辑技术过表达cho细胞中甘氨酸合成相关基因丝氨酸羟甲基转移酶、d-3-磷酸甘油酸脱氢酶、磷酸丝氨酸转氨酶和磷酸丝氨酸磷酸化酶，经过逐级过表达和单克隆筛选，得到过表达细胞株，命名为cho od细胞株，在cho od细胞株的基础上，对甘氨酸降解相关基因甘氨酸脱酶复合物和d-氨基酸氧化酶进行逐级敲除，最终得到改造后的底盘细胞，命名为cho od-ko细胞株；
9、s102.将cho od-ko细胞中的保守序列基因敲除和/或失活，细胞名称为；cho md；
10、s103.利用基因编辑技术构建辅助胶原合成和分泌的关键酶的细胞库。
11、作为本发明的进一步改进，所述保守序列基因包括procollagenn-endopeptidase、procollagen c-endopeptidase。
12、作为本发明的进一步改进，步骤s2的具体方法如下：
13、s201.构建插入人i型胶原a1和/或人i型胶原a2的表达载体质粒；
14、s202.pdw 265表达载体酶切；
15、s203.目的基因与表达载体连接；
16、s204.连接产物转化至top 10感受态。
17、作为本发明的进一步改进，所述表达载体质粒为pdw 265质粒。
18、作为本发明的进一步改进，所述表达载体pdw265质粒含有谷氨酰胺合成酶基因及其表达的调控元件，其中启动子为pgk。
19、作为本发明的进一步改进，所述表达载体pdw265质粒中目的基因表达的启动子为ef-1αα。
20、作为本发明的进一步改进，所述目的基因包括胶原目的基因、辅助酶系的基因。
21、作为本发明的进一步改进，步骤s3的具体方法如下：
22、s301.将构建的菌落pcr筛选阳性单克隆；
23、s302.稳定表达rhcol1的工程pool细胞株构建并筛选获得高产单克隆细胞株。
24、本发明进一步保护一种上述的构建方法构建得到的高通量筛选高产单克隆生产胶原细胞株。
25、本发明进一步保护一种胶原的生产方法，将上述构建的高通量筛选高产单克隆生产胶原细胞株进行发酵表达，获得重组胶原蛋白。
26、作文本发明进一步的改进，所述重组胶原蛋白为由三条a1链或两条a1链和一条a2链或三条a2链组成的其中任意一种或几种具有三螺旋结构的蛋白，所述a1链的氨基酸序列如seq id no.1；所述a2链的氨基酸序列如seq id no.2所示。
27、本发明具有如下有益效果：
28、本发明所用的cho细胞表达系统是现阶段生物制品类药物发酵生产的主流表达系统，安全性高。
29、本发明发酵纯化方式不是基于传统的胶原纯化的一般方法，采用哺乳动物表达系统，获得的胶原产量更高，空间结构完整，结构及修饰方式更接近天然胶原，具有广阔的应用前景。
1.一种生产胶原细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1的具体方法如下：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述保守序列基因包括procollagenn-endopeptidase、procollagen c-endopeptidase。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2的具体方法如下：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体质粒为pdw 265质粒。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述目的基因包括胶原目的基因、辅助酶系的基因。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体pdw 265质粒含有谷氨酰胺合成酶基因及其表达的调控元件，其中启动子为pgk。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体pdw265质粒中目的基因表达的启动子为ef-1α。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s3的具体方法如下：
10.一种如权利要求1-9任一项所述的构建方法构建得到的高通量筛选高产单克隆生产胶原细胞株。
11.一种胶原的生产方法，其特征在于，将权利要求8构建的高通量筛选高产单克隆生产胶原细胞株进行发酵表达，获得重组胶原蛋白。
12.根据权利要求11所述的生产方法，其特征在于，所述重组胶原蛋白为由三条a1链或两条a1链和一条a2链或三条a2链组成的其中任意一种或几种具有三螺旋结构的蛋白，所述a1链的氨基酸序列如seq id no.1；所述a2链的氨基酸序列如seq id no.2所示。
