本发明涉及呼吸道病毒检测，具体涉及基于rpa--crisprcas12a的常见呼吸道病毒多重检测试剂盒及其应用。
背景技术：
1、新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,sars-cov-2)爆发对全球的公共卫生产生破坏性影响，造成了重大的社会经济负担。新冠病毒引起的症状与其他常见呼吸道病毒感染的临床症状非常相似，如发烧、咳嗽和呼吸急促等。covid-19大流行阶段，来自不同国家的多达30-71％病例报告了sars-cov-2和其他呼吸道病毒发生共感染现象，常见的呼吸道病毒还包括甲型流感病毒(influenza a)、乙型流感病毒(influenza b)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)和副流感病毒(parainfluenza virus)。上述所有病毒均可引起上呼吸道和下呼吸道感染，多种病原体发生混合感染还会加重患者的临床症状，危及患者生命，而医生在没有可靠实验室分析的情况下难以区分病原体。因此准确、快速地诊断出致病病原体对于实施适当的抗病毒治疗、挽救生命、阻止流行病、减少不必要抗生素使用具有重要意义。
2、由于病毒基因突变频率较高，常规基于聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,pcr)或等温扩增原理的病毒核酸检测方法在扩增过程中易引入碱基错配，导致突变基因不能被准确识别，造成检测结果的“假阴性”。规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)是细菌中一种适应性免疫系统，crispr-cas系统以其特异性高、可开发性强、简单、高效等特点，成为基因编辑领域发展最快、应用最广的技术。
3、公布号为cn111534643a的中国专利申请文献，公开了一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用，其包括crispr-cas检测体系：crrna、引物对、cas蛋白和核酸探针。使用该专利的试剂盒和检测方法可用于高效、快速地检测/诊断呼吸道病原(例如甲型流感、乙型流感以及新型冠状病毒等)，特异性和灵敏度均较高，可用于呼吸道病原的检测与筛查，例如快速区分包括甲型流感、乙型流感以及新型冠状病毒在内的多种呼吸道病原。但该专利并没有公开本发明的crrna序列。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于rpa-crispr/cas12a检测呼吸道病毒的crrna及其应用。
2、本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
3、本发明的第一方面提出一种基于rpa-crispr/cas12a检测呼吸道病毒的crrna，所述呼吸道病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒或/和副流感病毒中的一种或多种；检测新型冠状病毒的crrna序列如seq id no:1或seq id no:4所示；检测甲型流感病毒的crrna序列如seq id no:7所示；检测乙型流感病毒的crrna序列如seq id no:10所示；检测呼吸道合胞病毒的crrna序列如seq id no:13所示；检测副流感病毒的crrna序列如seq id no:16所示。
4、有益效果：本发明中的crrna能够应用于呼吸道病毒的检测，能够将crispr-cas12a系统与重组聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,rpa)技术相结合，在提高诊断结果的可靠性方面表现出较高的灵敏度，在提升检测靶标数量，降低检测时间方面具有一定优势。
5、本发明的第二方面提出基于上述crrna扩增呼吸道病毒的rpa扩增引物，扩增新型冠状病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:2-3或seq id no:5-6所示；扩增甲型流感病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:8-9所示；扩增乙型流感病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:11-12所示；扩增呼吸道合胞病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:14-15所示；扩增副流感病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:17-18所示。
6、其中seq id no:2-3表示seq id no:2和seq id no:3，其他以此类推。
7、有益效果：本发明中的rpa扩增引物能够应用于呼吸道病毒的检测，能够将crispr-cas系统与重组聚合酶等温扩增重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification,rpa)技术相结合，在提高诊断结果的可靠性方面表现出超高的灵敏度和特异性。
8、rpa引物的制备方法包括：在已经确定好的五种常见呼吸道病毒及内质控基因crrna靶序列两侧设计rpa上下游引物，采用oligo7设计多对保守rpa引物，通过实时荧光曲线及终点荧光值，筛选出最佳引物组合。
9、本发明的第三方面提出一种基于rpa-crispr/cas12a检测呼吸道病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述rpa扩增引物和crispr/cas12a检测体系；所述crispr/cas12a检测体系包括上述的crrna序列、crispr/cas12a蛋白和ssdna报告荧光探针。
10、有益效果：本发明将crispr-cas系统与重组聚合酶等温扩增重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,rpa)技术相结合，应用于常见呼吸道病毒检测，在提高诊断结果的可靠性方面表现出较高的灵敏度。
11、优选地，所述ssdna报告荧光探针为利用6-羧基荧光(6-fam)和荧光淬灭剂(bhq1)标记ssdna。
12、优选地，所述ssdna报告荧光探针的序列为fam-ttatt-bhq1。
13、本发明的第四方面提出一种非疾病诊断目的采用上述试剂盒检测呼吸道病毒的方法，包括以下步骤：
14、(1)提取待测样本中的核酸；
15、(2)利用rpa扩增引物扩增待测样品中的核酸；
16、(3)利用crispr/cas12a检测体系切割扩增产物后反应，利用荧光检测仪检测荧光信号，确定待测样品中是否含有呼吸道病毒。
17、有益效果：本发明将crispr-cas系统与重组聚合酶等温扩增重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,rpa)技术相结合，应用于常见呼吸道病毒检测，在提高诊断结果的可靠性方面表现出较高的灵敏度，采用自研离心式芯片方案，在检测靶标数量方面具有一定优势。
18、优选地，所述试剂盒利用离心式微流控芯片或ep管进行检测。
19、优选地，所述试剂盒采用离心式微流控芯片时，将rpa扩增引物、crrna序列以冻干粉形式预埋至芯片反应腔，将crispr/cas12a检测体系预埋至芯片独立检测腔，将步骤(1)中提取的核酸加入储液池，通过离心，将步骤(1)中提取的核酸分流至芯片反应腔进行rpa扩增反应，扩增结束后，离心，扩增产物进入芯片独立检测腔，最后检测独立检测腔的荧光信号，当独立检测腔发出荧光，则表示待测样品中含有呼吸道病毒，当独立检测腔系未发出荧光，则表示待测样品未感染呼吸道病毒。
20、优选地，所述试剂盒采用ep管时，将crispr/cas12a检测体系滴入ep管盖内壁，将rpa扩增引物添加至ep管底部，并往ep管底部加入待测样本，待扩增反应结束后，通过离心将crispr/cas12a检测体系与rpa扩增产物混合进行检测反应，最后检测反应体系的荧光信号，当反应体系发出荧光，则表示待测样品中含有呼吸道病毒当反应体系未发出荧光，则表示待测样品未感染呼吸道病毒。
21、优选地，所述步骤(2)中rpa扩增引物的浓度为10μm，上下游引物浓度比为1:1。
22、优选地，所述步骤(2)中采用等温扩增体系，在42℃反应10min扩增获得特异性产物。
23、优选地，所述步骤(3)crispr/cas12a检测体系中crrna序列的浓度为2μm，ssdna报告荧光探针浓度为10μm，cas12a浓度为1μm。
24、优选地，所述crrna的制备方法包括以下步骤：针对新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒五种常见呼吸道病毒及内质控基因的保守序列，在保守序列中间寻找“tttn”结构作为pam基序，从而设计长度为18-24nt的crrna；其中，cas12a的crrna具有以下序列的特征：5′-uaauuucuacuaaguguagau-靶标特异性序列-3′，前半部分序列是crrna重复序列，并且对于所有cas12a都是相同的；后半部分是靶标特异性序列，该序列根据靶标序列进行设计，靶标特异性序列长度可以在18-24nt之间，但不包含pam(tttn)，pam基序应位于被靶向的非互补dna序列的5'末端。将设计好的crrna翻译成带有t7启动子的dna片段(t7-crrna)；同时，合成一条与启动子序列互补的寡核苷酸t7-all；将两条带有启动子序列的互补寡核苷酸(一条短寡核苷酸和一条长链)通过简单的退火反应即可形成非对称杂交链，即部分的dna模板形成双链。以杂交链dna为模板，通过t7体外转录体系即可转录出目的crrna。
25、本发明的优点在于：
26、本发明将crispr-cas12a系统与重组聚合酶等温扩增重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,rpa)技术相结合，应用于常见呼吸道病毒检测，在提高诊断结果的可靠性方面表现出较高的灵敏度，在检测靶点数及检测时间方面表现出一定优势。
1.基于rpa-crispr/cas12a检测呼吸道病毒的crrna，其特征在于：所述呼吸道病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒或/和副流感病毒；检测新型冠状病毒的crrna序列如seq id no:1或seq id no:4所示；检测甲型流感病毒的crrna序列如seq id no:7所示；检测乙型流感病毒的crrna序列如seq id no:10所示；检测呼吸道合胞病毒的crrna序列如seq id no:13所示；检测副流感病毒的crrna序列如seq id no:16所示。
2.权利要求1所述的crrna扩增呼吸道病毒的rpa扩增引物，其特征在于：扩增新型冠状病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:2-3或seq id no:5-6所示；扩增甲型流感病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:8-9所示；扩增乙型流感病毒的rpa扩增引物的序列如seqid no:11-12所示；扩增呼吸道合胞病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:14-15所示；扩增副流感病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:17-18所示。
3.一种基于rpa-crispr/cas12a检测呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求2所述rpa扩增引物和crispr/cas12a检测体系；所述crispr/cas12a检测体系包括权利要求1所述的crrna序列、crispr/cas12a蛋白和ssdna报告荧光探针。
4.根据权利要求3所述的基于rpa-crispr/cas12a检测呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：所述ssdna报告荧光探针为利用6-羧基荧光和荧光淬灭剂标记ssdna。
5.一种非疾病诊断目的采用权利要求3-4任一项所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述试剂盒利用采用离心式微流控芯片或ep管进行检测。
7.根据权利要求5所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述试剂盒采用离心式微流控芯片时，将rpa扩增引物、crrna序列以冻干粉形式预埋至芯片反应腔，将crispr/cas12a检测体系预埋至芯片独立检测腔，将步骤(1)中提取的核酸加入储液池，通过离心，将步骤(1)中提取的核酸分流至芯片反应腔进行rpa扩增反应，扩增结束后，离心，扩增产物进入芯片独立检测腔，最后检测独立检测腔的荧光信号，当独立检测腔发出荧光，则表示待测样品中含有呼吸道病毒，当独立检测腔系未发出荧光，则表示待测样品未感染呼吸道病毒。
8.根据权利要求5所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述试剂盒采用ep管时，将crispr/cas12a检测体系滴入ep管盖内壁，将rpa扩增引物添加至ep管底部，并往ep管底部加入待测样本，待扩增反应结束后，通过离心将crispr/cas12a检测体系与rpa扩增产物混合进行检测反应，最后检测反应体系的荧光信号，当反应体系发出荧光，则表示待测样品中含有呼吸道病毒当反应体系未发出荧光，则表示待测样品未感染呼吸道病毒。
9.根据权利要求5所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步骤(2)中rpa扩增引物的浓度为10μm，上下游引物浓度比为1:1。
10.根据权利要求5所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)crispr/cas12a检测体系中crrna序列的浓度为2μm，ssdna报告荧光探针浓度为10μm，cas12a浓度为1μm。
