本发明属于生物，涉及精氨酸乙酯和/或硫辛酸在促进细胞培养液中聚集体解聚中的应用。
背景技术：
1、原核或真核细胞会合成、分泌一种新型的细胞通讯方式——细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)。根据粒径大小、生物特性和合成途径不同，evs分为三种：①外泌体(exosomes)：粒径30～150nm；②微囊泡体(microvesicles)：粒径100～1000nm；③凋亡小体(apoptotic bodies)：粒径大于1000nm。细胞外囊泡具有和细胞类似的脂质双分子膜层结构，发挥着重要的生物学作用：①进行细胞间通讯，执行各类生理或病理功能，在免疫应答、病毒侵染、妊娠、心血管疾病、神经系统退行性疾病、癌症中发挥着重要作用；②作为疾病诊断的指标：外泌体含有的蛋白质、脂类、核酸、代谢物等成分，可作为癌症诊断和预后的标志物；③用于疾病预防与治疗，如间充质干细胞(msc)来源的胞外囊泡具有免疫调节、损伤修复的生物学功能；④作为疾病治疗的药物递送载体，如递送药物蛋白质、核酸、小分子物质等。
2、为了实现上述细胞外囊泡的功能和应用，需要对各种组织、细胞、体液来源的evs进行提取、富集、分离、纯化，获得适当纯度的目标细胞外囊泡。细胞外囊泡(如外泌体)的制备方法主要包括分级离心(超速离心、密度梯度离心)、聚乙二醇沉淀、超滤、亲和层析(免疫亲和层析和磷脂酰丝氨酸亲和层析法)、尺寸排阻色谱法(分子筛)和离子交换层析等。目前任何一种单一的外泌体分离纯化方式无法同时满足高纯度、低成本、高回收率及规模化生产等要求，采用不同分离或处理原理的工艺组合方式，是获得高纯度、高产量的细胞外囊泡的有效途径。
3、在采用上述方法进行细胞外囊泡分离纯化时，需要对含有细胞外囊泡的料液或细胞上清进行预处理，如通过离心或过滤等形式去除料液中的细胞或细胞碎片、较大的颗粒；加入核酸酶水解去除料液中的游离核酸片断等。料液中也含有一些生物大分子聚集体，形成纳米级颗粒，与胞外囊泡具备类似的理化性质，影响下游分离效率和胞外囊泡的纯度。例如当前对胞外囊泡的研究发现，细胞会分泌一些直径30～50nm蛋白聚体：exomere和supermere；同时，细胞在各种应激条件下，还会分泌应激颗粒(stress granules)等核酸蛋白聚合物(颗粒大小在0.1～2μm)，这些与胞外囊泡颗粒大小接近的蛋白聚合物很难去除，降低了胞外囊泡的纯度，影响胞外囊泡的临床使用效果。目前对这些蛋白聚体的去除并没有有效的解决方案。
4、综上所述，细胞外囊泡制备过程中，需首先对细胞进行培养获得含有细胞外囊泡的料液，再进行提取、分离、纯化等处理，而料液中核酸、蛋白、脂类等分泌物会形成大的聚体，与细胞外囊泡具有类似的纳米尺度，很难进行分离，因此，目前亟需开发能够有效去除细胞外囊泡的料液中蛋白和核酸等杂质的方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供精氨酸乙酯(arginineethylester,argee)和/或硫辛酸(lipoic acid，la)在促进细胞培养液中聚集体解聚中的应用，挖掘促进细胞培养液中聚集体解聚的物质，以期应用于去除细胞外囊泡的料液中蛋白和核酸等杂质的领域。
2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供精氨酸乙酯、其盐或溶剂化合物，和/或，硫辛酸、其盐或溶剂化合物在促进细胞培养液中聚集体解聚中的应用。
4、本发明中，挖掘能够促进细胞培养液中大分子聚集体解聚的物质，这些物质能够促进打开、分散，形成单体或者较小的颗粒、聚合物，便于通过切向流超滤(tangentialflow filtration,tff)或者分子筛(排阻色谱)等依据分子大小进行分离，将这些聚集体去除，具有广阔的应用前景，可广泛应用于需要对细胞培养液中大分子聚合物进行分离去除的领域，如从细胞培养液中分离纯化细胞外囊泡的领域等。
5、精氨酸乙酯结构式如式i所示，硫辛酸结构式如式ii所示。
6、
7、优选地，所述聚集体包括蛋白和/或核酸聚集体。
8、优选地，所述细胞培养液包括含细胞外囊泡的细胞培养液。
9、第二方面，本发明提供精氨酸乙酯、其盐或溶剂化合物，和/或，硫辛酸、其盐或溶剂化合物在制备促进细胞培养液中聚集体解聚的试剂中的应用。
10、第三方面，本发明提供一种促进细胞培养液中聚集体解聚的试剂盒，所述试剂盒含有精氨酸乙酯、其盐或溶剂化合物，和/或，硫辛酸、其盐或溶剂化合物。
11、第四方面，本发明提供一种含细胞外囊泡的细胞培养液的预处理方法，所述预处理方法包括：
12、向含有细胞外囊泡的细胞培养液中加入精氨酸乙酯、其盐或溶剂化合物，和/或，硫辛酸、其盐或溶剂化合物，进行超滤、分子筛等分离操作。
13、本发明中进一步开发可应用于细胞外囊泡分离纯化领域的方法，有效去除细胞外囊泡料液中的大分子聚集体，显著地降低了杂蛋白、核酸含量，提高了下游纯化的效率和纯度。
14、优选地，所述精氨酸乙酯、其盐或溶剂化合物的工作浓度为0.1～2mol/l，包括但不限于0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.2、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9mol/l等，优选为0.25～1mol/l。
15、优选地，所述硫辛酸、其盐或溶剂化合物的工作浓度为1～50mmol/l，包括但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、26、27、28、29、30、35、40、45、48或49mmol/l等，优选为10～30mmol/l。
16、优选地，所述超滤包括切向流超滤。
17、优选地，所述分离的截留尺寸为大于300kda，优选为500～750kda。
18、优选地，所述含细胞外囊泡的细胞培养液进行预处理前还包括超滤浓缩处理的步骤，具体包括：将细胞培养上清液分别经400～600×g、3500～4500×g离心去除细胞、细胞碎片，继而依次进行滤膜过滤和超滤浓缩3～5倍，用磷酸盐缓冲液洗滤5～8倍后作为起始样品。
19、优选地，所述预处理方法还可包括加入核酸酶的步骤。
20、作为优选的技术方案，所述预处理方法包括：
21、向含细胞外囊泡的细胞培养液中加入0.1～2mol/l的精氨酸乙酯、其盐或溶剂化合物，和/或，1～50mmol/l的硫辛酸、其盐或溶剂化合物，进行切向流超滤或分子筛分离，截留尺寸为500～750kda，收集截留端产物。
22、第五方面，本发明提供第四方面所述的含细胞外囊泡的细胞培养液的预处理方法在分离纯化细胞外囊泡中的应用。
23、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
24、本发明中，挖掘能够促进细胞培养液中大分子聚集体解聚的物质，利于聚集体的去除，同时，进一步开发可应用于细胞外囊泡分离纯化的方法，在聚集体解聚过程中使用了精氨酸乙酯和/或硫辛酸解聚物，用于打开料液中的大分子量的聚集体，有助于料液中非细胞外囊泡类产物的去除，提高细胞外囊泡的纯度。
1.精氨酸乙酯、其盐或溶剂化合物，和/或，硫辛酸、其盐或溶剂化合物在促进细胞培养液中聚集体解聚中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚集体包括蛋白和/或核酸聚集体；
3.精氨酸乙酯、其盐或溶剂化合物，和/或，硫辛酸、其盐或溶剂化合物在制备促进细胞培养液中聚集体解聚的试剂中的应用。
4.一种促进细胞培养液中聚集体解聚的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有精氨酸乙酯、其盐或溶剂化合物，和/或，硫辛酸、其盐或溶剂化合物。
5.一种含细胞外囊泡的细胞培养液的预处理方法，其特征在于，所述预处理方法包括：
6.根据权利要求5所述的含细胞外囊泡的细胞培养液的预处理方法，其特征在于，所述精氨酸乙酯、其盐或溶剂化合物的工作浓度为0.1～2mol/l，优选为0.25～1mol/l；
7.根据权利要求5或6所述的含细胞外囊泡的细胞培养液的预处理方法，其特征在于，所述分离的方法包括超滤或分子筛分离法；
8.根据权利要求7所述的含细胞外囊泡的细胞培养液的预处理方法，其特征在于，所述分离的截留尺寸为大于300kda，优选为500～750kda。
9.根据权利要求5-8任一项所述的含细胞外囊泡的细胞培养液的预处理方法，其特征在于，所述预处理方法包括：
10.权利要求5-9任一项所述的含细胞外囊泡的细胞培养液的预处理方法在分离纯化细胞外囊泡中的应用。
