本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种适用于鸽性别鉴定的qpcr引物和探针序列组合及应用。
背景技术：
1、随着人们生活水平的提高，肉鸽养殖业得到快速发展。在肉鸽规模化养殖中，鸽子性别快速、准确鉴定成为肉鸽养殖环节中重要的一环，直接影响着鸽厂的经济效益。鸽子是一种单态鸟，难以通过外形区分其性别，也不能像一般家禽那样进行性别鉴定。而且鸽子在配对是遵循较为严格的“一夫一妻”制，如果不及时给性成熟的鸽子配对会影响鸽子的繁殖率。所以，对鸽子性别准确的进行鉴定，可以大大提高配对成功率，淘汰不必要的公鸽，增加经济效益。
2、目前鸽子传统的性别鉴定方法包括：触肛法、骨骼鉴定法、体型鉴定法、羽毛鉴定法、叫声鉴别法等。但这些方法准确率不高，受限于鉴定者个人的经验与技术水平，难以大规模推广应用。随着分子生物学的发展，利用分子手段对鸽子进行性别鉴定，具有准确性高、操作简便、成本低、对动物伤害小等优点，如利用chd基因在染色体z和w上的内含子序列差异作为性别鉴定的分子标记，通过pcr扩增产物片段确定鸽子性别。该方法准确率高，但需要经过繁琐的鸽基因抽提步骤和琼脂糖凝胶电泳分析结果，难以在生产上推广应用。为满足对鸽子性别鉴定的快速、准确、易于推广的要求，本发明开发了一种适用于鸽性别鉴定的荧光定量pcr引物及应用。
技术实现思路
1、为改善现有技术不足，本发明提供一种适用于鸽性别鉴定的荧光定量pcr引物和探针序列组合及应用，本发明包括如下技术方案。
2、第一方面，本发明提供一种适用于鸽性别鉴定的荧光探针pcr引物。
3、所述引物为chdz和chdw的特异性引物，引物核苷酸序列（5’→3’）见seq id no:1~ seq id no:4。
4、seq id no:1：chdz-f：caaaacttgacctgtgtttgtca
5、seq id no:2：chdz-r：atccagagtatcttctgctccta
6、seq id no:3：chdw-f：atctctgggttttgaccaactaac
7、seq id no:4：chdw-r：tgctatctagcctgtcaaaaatgg
8、所述荧光探针为chdz和chdw靶标基因的特异性杂交探针，其核苷酸序列（5’→3’）见seq id no:5 ~ seq id no:6：
9、seq id no:5：chdz-p：fam-ctgcgccttccttcacttcca-bhq1
10、seq id no:6：chdw-p：vic-ttcattactgttgtttttggcttgtactt-bhq1
11、第二方面，本发明基于第一方面的引物探针序列，提供一种适用于鸽性别鉴定的荧光定量pcr检测方法。所述荧光定量pcr检测方法反应条件为：50 ℃ 2min ; 95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 变性10s，60 ℃退火20 s ( 此处收集荧光) ，共35个循环。
12、所述荧光定量pcr方法反应体系为：chdz-f 0.5 μl，chdz-r 0.5 μl，chdz-p 0.25μl，chdw-f 0.4 μl，chdw-r 0.4 μl，chdw-p 0.5 μl，2×novostart® probe qpcrsupermix (udg) 10 μl，加入纯化水补充体系至20 μl。
13、荧光定量pcr方法反应条件与反应体系建立所需标准品制备方法如下：将鸽子chdz基因(登录号:gu289184.1)和chdw基因(登录号:gu289183.1)序列串联后送基因公司进行合成，将合成片段克隆至puc-57载体并转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，提取阳性质粒，利用 nanodropnd-2000c微量分光光度计测定重组质粒浓度，并根据公式[拷贝数=质粒浓度×10 -9 ×6.02×10 23 /(660×质粒长度)] 计算其拷贝数，作为重组质粒标准品。
14、所述荧光定量pcr方法检测样本为口腔拭子，样品处理方法为将口腔拭子放入pcr离心管底部，来回旋转5-10次，将拭子丢弃，无需进行核酸提取，即可直接加入pcr反应体系进行检测。
15、所述荧光定量pcr方法结果判定方式如下：fam通道有循环数（ct值），vic通道没有循环数，对应鸽子为雌鸽；fam通道和vic通道均有ct值，对应鸽子为雄鸽。
16、第三方面，本发明提供一种适用于鸽性别鉴定的荧光定量pcr引物探针的应用。
17、本发明的有益效果为：本研究针对鸽子chd基因保守序列设计高特异性引物和荧光探针，建立灵敏度高，稳定性好的荧光定量pcr鸽子性别鉴定方法，同时开发口腔拭子直接检测的样本处理方式，消除需要提取核酸的繁琐处理方案，简化操作，符合快速、准确及经济的检测要求，适合在规模化鸽生产及繁育上推广应用。
1.一种适用于鸽性别鉴定的qpcr引物组合，其特征在于，包括特异性针对chdz靶标基因的引物chdz-f和chdz-r，以及特异性针对chdw靶标基因的引物chdw-f和chdw-r。
2.根据权利要求1所述的一种适用于鸽性别鉴定的qpcr引物组合，其特征在于，所述chdz和chdw靶标基因扩增上下游引物的核苷酸序列如下：
3.一种适用于鸽性别鉴定的荧光探针，其特征在于，包括特异性针对chdz靶标基因的荧光探针chdz-p，以及特异性针对chdw靶标基因的荧光探针chdw-p。
4.根据权利要求3所述的一种适用于鸽性别鉴定的荧光探针，其特征在于，所述chdz-p和chdw-p靶标基因荧光探针的核苷酸序列如下：
5.一种使用权利要求1所述的引物组合和权利要求3所述的荧光探针进行鸽性别鉴定的荧光定量pcr检测方法，其特征在于，包括利用所述引物和探针进行pcr扩增，并通过检测不同荧光通道的ct值来判定鸽子的性别。
6.一种用于荧光定量pcr检测方法的重组质粒标准品，其特征在于，所述标准品包含串联的鸽子chdz基因和chdw基因序列，克隆至puc-57载体并转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，其制备方法包括提取阳性质粒、测定浓度并计算拷贝数。
7.一种利用权利要求6所述重组质粒标准品进行鸽性别鉴定荧光定量pcr检测方法的标准曲线建立方法。
8.一种鸽性别鉴定样本的处理方法，其特征在于，包括将口腔拭子放入pcr离心管底部，旋转数次后丢弃拭子，无需进行核酸提取，直接加入pcr反应体系进行检测。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的鸽性别鉴定方法，其特征在于，结果判定方式如下：fam通道有ct值而vic通道无ct值，则判定为雌鸽；fam通道和vic通道均有ct值，则判定为雄鸽。
10.权利要求1中所述的引物组合、权利要求2所述的荧光探针，以及权利要求5至9中任一项所述的方法在鸽性别鉴定中的应用。
