本发明属于疫苗，具体涉及一种重组森林脑炎病毒表面蛋白、疫苗及其制备方法与应用，尤其涉及该重组森林脑炎病毒表面蛋白、疫苗在制备治疗或预防森林脑炎病毒的药物中的应用。
背景技术：
1、森林脑炎(forestencephalitis)是一种中枢神经系统急性传染病，又称为蜱传脑炎，俄罗斯春夏脑炎，流行于中欧、东欧、北欧和我国东北等森林地区。临床症状有，发热、头痛、恶心、呕吐、神志不清，颈部、肩部和上肢肌肉瘫痪，病情严重会导致患者死亡。森林脑炎由蜱传脑炎病毒(tick-borneencephalitis virus，tbev)引起，主要通过蜱虫叮咬传播。tbev属于黄病毒科黄病毒属，该属有70多种病毒，如寨卡病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒等。tbev为单股正链rna病毒(10kb)，含包膜，直径50nm，接近正20面体，表面主要为e蛋白，和少部分m蛋白。e蛋白区含抗原决定簇，并可诱导机体产生保护性的中和抗体。tbev包含3种亚型，分别为欧洲亚型、西伯利亚亚型、远东亚型。不同亚型引起的临床症状相似，但疾病的发展和严重程度并不相同。我国的流行株为远东亚型，危害最为严重，病死率可达35％。目前森林脑炎尚无特异性治疗方案，因此接种疫苗预防tbev感染是最为有效的手段。对于森林游客，科考队，伐木工等高危人群，接种疫苗是必要的保护措施。
2、现有技术中，国内外上市的疫苗均为基于全病毒的灭活疫苗。国外的全病毒灭活苗首先在鸡胚中培养，国内的全病毒灭活苗首先在原代地鼠肾细胞中培养，然后纯化并灭活病毒，最后在疫苗内补充佐剂、稳定剂和缓冲液/防腐剂。但全病毒灭活疫苗具有生产周期较长和灭活不彻底的缺点，并且因为在鸡胚或原代地鼠肾细胞中培养，批次间差异大。此外，这种疫苗生产过程中生物安全风险高，根据我国制定的人间传染的病原微生物名录，tbev按危害程度划分为第一类病毒，该病毒培养的生物安全级别是bsl-3级，而维持高等级的生物安全实验室或车间的费用高昂，增加了生产成本。由于成本高昂且需要多次接种，在一些流行国家，接种疫苗的覆盖率仍然很低。因此，迫切需要改进现有的tbev疫苗，并引入新的疫苗以用于广泛接种。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明为解决现有技术中的森林脑炎全病毒灭活疫苗生产周期较长，灭活不彻底，批次间差异大，生产成本高的技术问题，提供一种重组森林脑炎病毒表面蛋白、疫苗及其制备方法与应用。该重组森林脑炎病毒疫苗不用培养活毒，因此克服了灭活苗生物安全风险高的缺点。也不需要使用bsl-3级生物安全实验室或车间，因此降低了生产成本。还不需要使用鸡胚或者原代地鼠肾细胞，而是使用基因重组技术表达，因此批间一致性好。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供一种重组森林脑炎病毒表面蛋白，包括依次连接的信号肽、森林脑炎病毒prm蛋白和森林脑炎病毒e蛋白。
4、优选的是，所述信号肽为jev信号肽；更优选的是，所述jev信号肽的氨基酸序列如seq id 2所示。
5、优选的是，所述森林脑炎病毒prm蛋白来自森林脑炎病毒森张株；更优选的是，所述森林脑炎病毒prm蛋白的氨基酸序列如seq id 3所示。
6、优选的是，所述森林脑炎病毒e蛋白来自森林脑炎病毒森张株；更优选的是，所述森林脑炎病毒e蛋白的氨基酸序列如seq id 4所示。
7、优选的是，所述重组森林脑炎病毒表面蛋白的氨基酸序列如seq id1所示。
8、本发明还提供编码上述重组森林脑炎病毒表面蛋白的基因。
9、优选的是，所述编码重组森林脑炎病毒表面蛋白的基因的核酸序列如seq id 5所示。
10、本发明还提供编码上述重组森林脑炎病毒表面蛋白的基因的制备方法，步骤如下：
11、s1.提取编码森林脑炎病毒的全基因组；
12、s2.通过反转录pcr得到编码森林脑炎病毒prm蛋白与森林脑炎病毒e蛋白的prm+e基因片段；
13、s3.通过pcr将信号肽基因连接在prm+e基因片段的n端，得到重组森林脑炎病毒表面蛋白的基因。
14、本发明还提供表达或含有上述重组森林脑炎病毒表面蛋白的疫苗。
15、优选的是，所述疫苗的种类包括mrna疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗或病毒载体疫苗；
16、更优选的是，所述疫苗为mrna疫苗，所述mrna疫苗含有5’utr、3’utr和polya，5’utr与信号肽基因连接，3’utr与森林脑炎病毒e蛋白基因连接，polya和3’utr连接；
17、又更优选的是，所述5’utr的序列如seq id 6所示，所述3’utr的序列如seq id 7所示，mrna疫苗的核酸序列如seq id 8所示。
18、本发明还提供上述mrna疫苗的制备方法，步骤如下：
19、s1.将编码重组森林脑炎病毒表面蛋白的基因通过bsmb i限制性内切酶构建到用于mrna体外转录的质粒中，得到重组质粒；
20、s2.将重组质粒用bspqi限制性内切酶进行线性化反应，得到线性化模板；
21、s3.对得到的线性化模板进行体外转录反应，反应完成后，消除线性化模板，得到未加帽的mrna；
22、s4.用磁珠对未加帽的mrna纯化，漂洗后，溶解到无核酶的去离子水中，进行加帽反应，再用磁珠纯化，得到加帽的mrna；
23、s5.对加帽的mrna进行包封，得到重组森林脑炎病毒mrna疫苗。
24、本发明还提供上述重组森林脑炎病毒表面蛋白、重组森林脑炎病毒疫苗在制备治疗或预防森林脑炎病毒的药物中的应用。
25、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
26、本发明的重组森林脑炎病毒表面蛋白，包括信号肽、森林脑炎病毒prm蛋白和森林脑炎病毒e蛋白，三者可以组装成病毒样颗粒。病毒样颗粒一方面与病毒的天然形式相似，具有许多天然的抗原表位，具有高抗原性和强免疫原性的潜力。另一方面不含病毒的基因组，安全性高。病毒样颗粒疫苗可在酵母、细菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞中产生，易于大规模生产，具有成本效益。是目前安全性最高的一种新型候选疫苗。其中，森林脑炎病毒e蛋白在体内能诱导抗体的产生。森林脑炎病毒prm蛋白是一种糖蛋白，为m蛋白的前体，在病毒成熟过程中prm经特异性酶切后形成m蛋白，m蛋白做为基质蛋白，可以促进病毒样颗粒的产生。信号肽可以促进蛋白分泌表达，也帮助prm切割成m蛋白。
27、本发明的重组森林脑炎病毒表面蛋白，能在细胞内翻译组装成病毒样颗粒，也能在小鼠体内产生高水平中和抗体。此外，其mrna疫苗还具备以下优点：其一，在细胞质中发挥作用，不进入细胞核，不仅减少了药物递送的难度，而且减少了基因组整合的担忧；其二，mrna疫苗以体外转录方式制备，因此不需要细胞，不仅减少生物安全风险，也缩短了生产时间，批次一致性好；其三，mrna疫苗即能引起b细胞免疫反应，也可能引起高水平的t细胞免疫反应，提高疫苗保护率。这些特性都让mrna疫苗成为非常有潜力的新型mrna疫苗。
1.重组森林脑炎病毒表面蛋白，其特征在于，包括依次连接的信号肽、森林脑炎病毒prm蛋白和森林脑炎病毒e蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组森林脑炎病毒表面蛋白，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的重组森林脑炎病毒表面蛋白，其特征在于，
4.根据权利要求3所述的重组森林脑炎病毒表面蛋白，其特征在于，
5.编码权利要求1-4任意一项所述的重组森林脑炎病毒表面蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的编码重组森林脑炎病毒表面蛋白的基因，其特征在于，所述编码重组森林脑炎病毒表面蛋白的基因的核酸序列如seq id 5所示。
7.根据权利要求5所述的编码重组森林脑炎病毒表面蛋白的基因的制备方法，其特征在于，步骤如下：
8.含有权利要求1-4任意一项所述的重组森林脑炎病毒表面蛋白的疫苗。
9.根据权利要求8所述的重组森林脑炎病毒表面蛋白的疫苗，其特征在于，所述疫苗的种类包括mrna疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗或病毒载体疫苗。
10.根据权利要求9所述的重组森林脑炎病毒表面蛋白的疫苗，其特征在于，
11.根据权利要求10所述的重组森林脑炎病毒表面蛋白的疫苗，其特征在于，
12.根据权利要求10所述的重组森林脑炎病毒表面蛋白的疫苗，其特征在于，mrna疫苗的制备方法，步骤如下：
