本发明属于生物医药领域，涉及可降低肿瘤细胞内特定mrna含量的dna探针分子及其应用。
背景技术：
1、kras(kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物)蛋白是临床癌症治疗中的相关靶标。在90％胰腺癌、20–25％肺癌以及其他类型的癌症中存在kras突变。通常，kras突变最常发生在glycine-12(g12)位或glycine-13(g13)位的密码子上。kras突变的细胞通过分泌各种细胞因子、趋化因子和生长因子促进癌症生长、免疫抑制和重塑肿瘤微环境。因此，抑制kras蛋白可以抑制癌症的发展。然而，kras蛋白分子较小且表面相对平滑，难以找到小分子药物结合的“口袋”，另外，kras对核苷酸gtp亲和力极强，药物很难与gtp竞争，结合kras蛋白并抑制其活性。因此，kras突变(除g12c突变)已被确定为不可成药的靶点。
2、目前针对kras的潜在基因疗法有小干扰rna(sirna)和反义核酸药物。两者的作用机制分别为：sirna进入细胞后，整合到其他蛋白质中形成rna诱导的沉默复合物，双链展开形成单链，与靶mrna结合，诱导mrna切割。而反义核酸一方面是通过与靶mrna结合形成空间位阻，阻止核糖体与mrna结合，另一方面其与mrna结合后激活内源性rnase或核酶，降解mrna，从而抑制转录。虽然sirna和反义核酸可用于野生型与突变型细胞的给药，但对肿瘤细胞与正常细胞中的靶标mrna均有降解作用，如bcl-2等在肿瘤细胞和正常细胞均表达的mrna，因此其易对正常细胞产生毒副作用，无法实现特异性的肿瘤抑制。
3、所以需要开发一种既可以识别野生型和突变型靶标mrna，又能够靶向肿瘤细胞中靶标mrna发挥作用，而对正常细胞无明显毒性的多功能dna探针。
技术实现思路
1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种可降低肿瘤细胞内特定mrna含量的dna探针分子。
2、本发明还要解决的技术问题是提供了一种适合所述dna探针分子应用的核酸递送系统。
3、本发明最后要解决的技术问题是提供了dna探针分子、所述的核酸递送系统在制备治疗癌症的药物中的用途。
4、技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种可降低肿瘤细胞内特定mrna含量的dna探针分子，所述dna探针分子内有8～12个碱基配对，形成3’端缩进而5’端突出的发夹样结构，5’突端突出部分为单链dna，其序列与靶标mrna中特定位点12～25个碱基序列互补，当与目标mrna杂交后会形成dna-rna双链，探针3’末端的单个核苷酸正好处于所述dna-rna双链中特定位点处，使该特定位点处形成三碱基重叠结构。
5、作为优选，所述dna探针分子内有10个碱基配对，其序列与靶标mrna中特定位点12-18个碱基序列互补；进一步优选地，其序列与靶标mrna中特定位点16或18个碱基序列互补；
6、进一步地，所述的dna探针由两部分组成，一部分为与靶标互补配对的序列，另一部分为茎环序列。
7、作为优选，dna探针中3’末端的碱基类型为c、t、g、a中的一种。
8、其中，所述靶标mrna为kras mrna或bcl-2mrna。
9、其中，当所述靶标mrna为kras mrna时，所述dna探针的3’末端核苷酸序列可与kras mrnag12位点处核苷酸序列互补或者不互补，优先选择不互补。
10、其中，当所述靶标mrna为kras mrna时，所述特定位点是glycine-12位点，作为优选，所述glycine-12位点为kras g12s突变时，则所述匹配的dna探针分子的序列如seq idno.1所示，作为优选，所述glycine-12位点为kras g12d突变时，则所述匹配的dna探针分子的序列如seq id no.2所示。
11、tcttgcctacgccactgaagtagcacttttgtgctacttcc(针对kras g12s突变)(seq idno.1)；
12、ctcttgcctacgccatgaagtagcacttttgtgctacttcc(针对kras g12d突变)(seq idno.2)；
13、其中，当所述靶标mrna为bcl-2mrna时，则特定位点是methionine-177，所述匹配的dna探针分子的序列如seq id no.3所示。
14、本
技术实现要素：
还包括所述的dna探针分子在制备核酸递送系统中的应用。
15、其中，所述核酸递送系统包括脂质纳米颗粒、纳米金颗粒、多肽胶束、外泌体或其他能将dna探针递送到胞内的各类载体。
16、本发明内容还包括一种核酸递送系统，所述核酸递送系统包括所述的dna探针分子。
17、本发明内容还包括所述的dna探针分子、所述的核酸递送系统在制备治疗癌症的药物中的用途。
18、其中，将针对kras的dna探针溶于不含血清不含双抗的培养基中，再将其与转染剂混合孵育，通过静电相互作用，dna探针进入转染剂内部空腔，然后将混合物加入细胞中。突变型dna探针进入肿瘤细胞后，与突变型kras mrna形成稳定的三碱基重叠结构，从而fen1酶发挥识别和切割作用，影响细胞活性。而其无法与野生型kras mrna形成良好的三碱基重叠结构，因此fen1酶不能产生切割，无法影响kras mrna的表达，即无法产生细胞毒性。所以该dna探针可以对野生型细胞和突变型细胞有较好的区分。由于突变型dna探针与野生型dna探针在细胞内产生切割依赖于fen1酶，而肿瘤细胞中fen1酶的表达高于正常细胞，因此，所述的dna探针即使与正常细胞的kras mrna结合也无法发挥切割作用，从而对正常细胞无毒，实现对肿瘤细胞与正常细胞的区分。
19、进一步地，所述转染剂为阳离子脂质体，如lipo 6000，包括但不限于一种。
20、进一步地，所述化疗药物为与kras上下游靶标有关的药物，如吉非替尼，包括但不限于一种。
21、为了更好的将dna探针与化疗药物一起递送至肿瘤细胞，采用认可度较高的脂质纳米颗粒作为递送平台。脂质纳米颗粒(lnp)的脂质部分由dlin-mc3-dma，二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)，胆固醇和dmg-peg 2000组成。lnp通过微流控系统制备，即溶解在乙醇相的混合脂质和化疗药物与溶解在柠檬酸盐缓冲液中的dna探针通过双注射器泵以1:3的流速通过微流控芯片，然后将其置于pbs中透析以除去乙醇和酸性缓冲液，最后超滤浓缩。
22、其中，所述癌症包括但不仅限于肺癌、乳腺癌或宫颈癌，其他癌症也适用。
23、发明机理：本发明所述dna探针经载体递送进入细胞后，可以与编码kras或bcl-2的mrna互补配对，形成三碱基重叠结构，在肿瘤细胞内fen1酶的作用下切割mrna，使krasmrna或bcl-2mrna表达降低，影响细胞功能，产生细胞毒性。当kras基因为野生型时，只有针对野生型kras的dna探针可以与靶标结合形成稳定的三碱基结构并在fen1酶存在的条件下切割，产生细胞毒性；而针对突变型kras的dna探针无法与靶标形成三碱基结构，不发生切割反应，对kras野生型细胞的毒性较小。反之亦然。此外，由于正常细胞中fen1酶的表达量较低，因此，所述dna探针对正常细胞中的靶标mrna影响较小，且对正常细胞具有更低的毒性。将该dna探针与化疗药物联用，不仅可以改善化疗药物的疗效，还可以降低化疗药物的使用剂量，减小其毒副作用，实现协同抑制肿瘤细胞的目的。
24、有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的探针分子可以识别kras突变型和野生型肿瘤细胞。本发明的探针分子可以区分正常细胞而作用于肿瘤细胞中的靶标mrna，如bcl-2mrna，具有良好的选择性与特异性。本发明的探针分子可通过切割靶标mrna实现对肿瘤细胞的杀伤作用，可以作为一种抑制肿瘤细胞生长的新型方法。本发明将dna探针序列改变，可作用于不同的靶点。本发明可以与其他化疗药物联用，实现更好的协同效果。本发明可以降低化疗药物的使用剂量，降低化疗药物的毒副作用。本发明的dna探针比rna探针更容易合成与保存、成本较低。本发明诱导dna探针发挥作用的是肿瘤细胞内源性fen1酶，不需要额外递送外源fen1酶，体系构成简单、容易。
1.一种可降低肿瘤细胞内特定mrna含量的dna探针分子，其特征在于，所述dna探针分子内有8~12个碱基配对，形成3’端缩进而5’端突出的发夹样结构，5’突端突出部分为单链dna，其序列与靶标mrna中特定位点12~25个碱基序列互补，当与目标mrna杂交后会形成dna-rna双链，探针3’末端的单个核苷酸正好处于所述dna-rna双链中特定位点处，使该特定位点处形成三碱基重叠结构。
2.根据权利要求1所述的可降低肿瘤细胞内特定mrna含量的dna探针分子，其特征在于，所述靶标mrna为kras mrna或bcl-2 mrna。
3.根据权利要求1所述的可降低肿瘤细胞内特定mrna含量的dna探针分子，其特征在于，当所述靶标mrna为kras mrna时，所述dna探针的3’末端核苷酸序列可与kras mrna g12位点处核苷酸序列互补或者不互补，优先选择不互补。
4.根据权利要求1所述的可降低肿瘤细胞内特定mrna含量的dna探针分子，其特征在于，当所述靶标mrna为kras mrna时，所述特定位点是glycine-12位点，作为优选，所述glycine-12位点为kras g12s突变时，则所述匹配的dna探针分子的序列如seq id no.1所示，作为优选，所述glycine-12位点为kras g12d突变时，则所述匹配的dna探针分子的序列如seq id no.2所示。
5.根据权利要求1所述的可降低肿瘤细胞内特定mrna含量的dna探针分子，其特征在于，当所述靶标mrna为bcl-2 mrna时，则特定位点是methionine-177，所述匹配的dna探针分子的序列如seq id no.3所示。
6.权利要求1~5任一项所述的dna探针分子在制备核酸递送系统中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述核酸递送系统包括脂质纳米颗粒、纳米金颗粒、多肽胶束、外泌体或其他能将dna探针递送到胞内的各类载体。
8.一种核酸递送系统，其特征在于，所述核酸递送系统包括权利要求1~5任一项所述的dna探针分子。
9.权利要求1~5任一项所述的dna探针分子、权利要求8所述的核酸递送系统在制备治疗癌症的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述癌症包括肺癌、乳腺癌、宫颈癌。
