本发明涉及一种外泌体标志物的阵列检测方法及应用，具体涉及使用含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒组成的两用阵列分离检测外泌体的方法并应用于对胰腺导管腺癌的早期诊断，高危人群排查以及疾病分期，属于生物医学检测。
背景技术：
1、外泌体是一种细胞外囊泡，从亲代细胞继承了丰富的生物学信息，已被发现与代谢重编程和癌症进展有关。有研究指出血浆来源的外泌体可以识别特定的癌症类型。在外泌体的各种内容物中，代谢物作为生化途径的组成部分，具有重要的基本调节作用，可以用作包括疾病在内的多种生物状况的诊断标志物。探索外泌体代谢谱正成为液体活检的一种发展趋势。然而，相关研究面临着各种问题，如外泌体分离的速度、代谢物检测的吞吐量以及大量代谢数据的处理。
2、关于外泌体分离，人们致力于基于纳米材料的方法，特别是钛金属有机框架及其衍生物，因为它们的结构可控，活性位点丰富。这些方法有望节省低成本和时间，同时确保高效率、回收率和可重复性。它们解决了传统技术耗时和昂贵的问题，如被视为金标准的超速离心、以高灵敏度而闻名的免疫亲和性和以尺寸选择性而闻名的尺寸排阻色谱。在代谢物检测方面，研究集中在纳米材料辅助的激光解吸/电离质谱(ldi-ms)上，其特点是高通量，这在小分子的非靶向分析中得到了广泛认可。与核磁共振(nmr)和液相色谱-质谱(lc-ms)等常见技术相比，ldi-ms因其大大提高的通量而显著缩短了检测时间而脱颖而出。
3、机器学习(ml)在应对复杂和海量数据集激增带来的挑战方面表现出了显著的有效性。监督机器学习，是机器学习和人工智能的一个子类。它的核心在于使用标记数据集来训练算法，以便对数据进行分类或准确预测结果。这种学习方法通过已有标记数据进行学习，训练模型能够从未标记数据中进行预测和分类。在监督学习中，每个样本都有标签(标记)，模型可以利用这些标签来学习分类模型。基于监督机器学习有可能为新数据构建具有准确预测能力的模型。将机器学习与外泌体代谢数据相结合，将有可能对临床生物标志物的挖掘和疾病的诊断有着优异的效果。
技术实现思路
1、本发明的目的是：为了提高外泌体的ldi-tof ms(激光解吸电离飞行时间质谱)分析通量，本发明提供一种两用(两用指的是分离外泌体和检测外泌体的作用)阵列的外泌体的分离检测方法，该方法利用含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒组成的两用阵列分离外泌体，并进行原位质谱检测，含钛金属有机框架衍生物与外泌体表面的磷脂有强相互作用，且阵列式排布极大地缩短了实验时间，因此本发明方法可以更快速、更灵敏、更简便地分离检测外泌体，应用于胰腺癌的诊断具有较高的临床价值和良好的应用前景。
2、为了实现上述目的，本发明提供了一种外泌体的分离检测方法，包括如下步骤：
3、步骤1：将血清样本滴加在设有含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒的靶板上，使得血清样本中的外泌体与含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒结合(静置孵育使二者相结合)并洗涤干燥，得到结合有外泌体的检测靶板，所述含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒在靶板上呈阵列式分布；
4、步骤2：将步骤1所得的结合有外泌体的检测靶板直接进行ldi-tof ms分析。
5、本发明的一些实施方案中，所述步骤1中含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：
6、步骤1.1：将2-氨基对苯二甲酸溶解于反应溶剂中，充分搅拌超声后加入钛前驱物，混合均匀，得到含钛溶液；
7、步骤1.2：将步骤1.1所得含钛溶液转移至反应容器中进行加热反应，反应结束后冷却至室温，收集固体产物并洗涤，然后干燥，得到含钛金属有机框架纳米颗粒；
8、步骤1.3：将步骤1.2所得含钛金属有机框架纳米颗粒进行煅烧，得到含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒。
9、本发明的一些实施方案中，所述步骤1中设有含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒的靶板的制备方法包括：将所述含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒在去离子水中分散均匀，滴加在设有阵列点的靶板上，使含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒分布于阵列点上。
10、本发明的一些实施方案中，所述步骤1.1中的反应溶剂为n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基甲酰胺与甲醇的混合溶剂；所述钛前驱物为酞酸酯。
11、本发明的一些实施方案中，所述混合溶剂中n,n-二甲基甲酰胺与甲醇的体积比为7：3；所述酞酸酯为钛酸四丁酯。
12、本发明的一些实施方案中，所述步骤1.2中的反应温度为100～200℃，时间为6～10小时。
13、本发明的一些实施方案中，所述步骤1.2中干燥的条件为：于40～60℃下真空干燥。
14、本发明的一些实施方案中，所述步骤1.3中煅烧的温度为300～500℃，时间为1-4小时。
15、本发明的一些实施方案中，所述步骤1中的血清样本为受试者血清的磷酸盐缓冲溶液。
16、本发明的一些实施方案中，所述步骤2中ldi-tof ms分析的具体条件为：采用355nm nd:yag激光光源，激光频率为2000hz，加速电压为20kv，其中离子源1处电压为20kv，离子源2处电压为17.6kv；采集模式为反射阳离子模式，采集范围m/z为100-1000da；每个样本重复5次测试；从flexcontrol 3.4获得质谱数据，并在flexanalysis 3.4中导出数据。
17、本发明还提供了一种含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒在制备用于诊断胰腺癌的产品中的应用；所述含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒采用前述方案中描述的方法步骤制备。所述产品可以是试剂盒、诊断装置或系统。
18、本发明的一些实施方案中，所述应用基于批量样本进行ldi-tof ms分析，获得外泌体代谢物指纹图谱并根据所述指纹图谱做机器学习算法获得概率得分；所述样本为受试者血清样本。
19、本发明的一些实施方案中，所述获取外泌体代谢物指纹图谱的具体条件为：将批量样本进行ldi-tof ms分析获得的质谱图用总离子电流归一化质谱峰强度，对每个样本的质谱图取平均值，对齐峰坐标的公差0.4，将每个样本的质谱峰强度列表，即得代谢物指纹图谱，使用基于代理变量分析的方法对代谢物指纹图谱进行校正；所述批量样本包括训练集和测试集；
20、本发明的一些实施方案中，所述机器学习算法步骤包括：输入训练集样本数据，训练模型，评估模型，输入测试集样本数据盲测，评估测试集盲测结果。
21、本发明的一些实施方案中，选用的机器学习算法为深度学习算法。
22、本发明的一些实施方案中，所述代谢指纹图谱利用特征选择算法提取潜在生物标志物面板，再将生物标志物面板结合深度学习算法获得概率得分。
23、本发明还提供了一种胰腺癌诊断系统，包括外泌体分离装置和用于分析外泌体代谢物质的激光解吸电离飞行时间质谱仪，所述外泌体分离装置设有阵列式排布的含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒；
24、所述激光解吸电离飞行时间质谱仪用于获取受试者样本中外泌体代谢物质的ldi-tof ms质谱图，并基于所述质谱图在机器学习算法中的概率得分得到获得诊断结果。
25、本发明的一些实施例方案中，还包括诊断装置，所述诊断装置设有机器学习模块和诊断模块；所述机器学习模块用于将训练集样本数据训练模型，并在训练好的模型中输入待测样本数据，获得待测样本的概率得分；
26、所述诊断模块用于根据机器学习模块获得的概率得分输出诊断结果。
27、本发明的一些实施方案中，所述诊断系统用于筛查胰腺癌高风险人群，胰腺癌的早期诊断，胰腺癌的分期或分型。
28、本发明的一些实施例方案中，所述质谱图中，使用一个含有四个元素的数组表示概率得分，每一个元素代表一类人群，如果概率得分数组中某一元素的值大于其他三个元素，则判断受试者属于该类人群。即四个元素分别为模型判定该样本属于健康、高危、胰腺癌前期、后期人群的概率，和为1，其中哪个元素较大则模型认为该样本属于哪类人群。例如某样本得分为(0，0，1，0)，则该样本被模型认为是胰腺癌前期。
29、本发明利用制备的阵列式排布的含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒可以通过强相互作用和缩短实验时间高效分离外泌体，而且因为强紫外吸收和高导电性可以高效离子化外泌体成分，成功提取了外泌体代谢物指纹图谱，借助机器学习算法，实现了胰腺导管腺癌的早期诊断，高危人群排查以及疾病分期，具有高灵敏度、高特异性、高精密度和高准确性，这表明本发明方法在大规模疾病诊断方面具有广阔的应用前景。
30、本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
31、(1)本发明提供的外泌体分离检测方法利用了阵列式排布的含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒，与外泌体具有强相互作用，阵列式排布能明显缩短实验时间，因此本发明方法可以更快速、更灵敏、更有选择性地分离外泌体；
32、(2)含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒的强紫外吸收和高导电性有利于吸收激光能量并将外泌体成分离子化，因此本发明方法能够高效地将分离获得的外泌体代谢物离子化，产生显著的质谱信号；
33、(3)本发明将检测得到的代谢指纹图谱通过机器学习算法识别胰腺癌早/晚期患者、胰腺癌高风险人群和健康人的外泌体代谢差异，可以以高准确性和灵敏度区分胰腺癌早/晚期患者、胰腺癌高风险人群和健康人，成功实现了胰腺导管腺癌的早期诊断，高危人群排查以及疾病分期。
1.一种外泌体的分离检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，所述步骤1中含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的分离检测方法，其特征在于，所述步骤1.1中的反应溶剂为n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基甲酰胺与甲醇的混合溶剂；所述钛前驱物为酞酸酯。
4.如权利要求2所述的分离检测方法，其特征在于，所述步骤1.2中的反应温度为100～200℃，时间为6～10小时；
5.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，所述步骤1中的血清样本为受试者血清的磷酸盐缓冲溶液。
6.一种含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒在制备用于诊断胰腺癌的产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用基于批量样本进行ldi-tof ms分析，获得外泌体代谢物指纹图谱并根据所述指纹图谱做机器学习算法获得概率得分；所述样本为受试者血清样本。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述获取外泌体代谢物指纹图谱的具体条件为：将批量样本进行ldi-tof ms分析获得的质谱图用总离子电流归一化质谱峰强度，对每个样本的质谱图取平均值，对齐峰坐标的公差0.4，将每个样本的质谱峰强度列表，即得代谢物指纹图谱，使用基于代理变量分析的方法对代谢物指纹图谱进行校正；所述批量样本包括训练集和测试集；
9.一种胰腺癌诊断系统，其特征在于，包括外泌体分离装置和用于分析外泌体代谢物质的激光解吸电离飞行时间质谱仪，所述外泌体分离装置设有阵列式排布的含钛金属有机框架衍生物纳米颗粒；
10.如权利要求9所述的胰腺癌诊断系统，其特征在于，还包括诊断装置，所述诊断装置设有机器学习模块和诊断模块；所述机器学习模块用于将训练集样本数据训练模型，并在训练好的模型中输入待测样本数据，获得待测样本的概率得分；所述诊断模块用于根据机器学习模块获得的概率得分输出诊断结果。
