本发明属于微生物检测，具体涉及一种胰岛素抵抗模型的构建方法。
背景技术：
1、糖尿病前期是糖尿病的早期指标，在当患者被诊断为葡萄糖耐量受损(impairedglucose tolerance，igt)和/或空腹血糖受损(impaired fasting glucose，ifg)时发生。igt和ifg的两个主要特征是胰岛素抵抗(insulin resistance，ir)和胰腺β细胞功能下降。糖尿病前期和糖尿病的发病通常始于细胞的胰岛素抵抗。大多数情况下，在2型糖尿病的初始阶段，个体开始表现出胰岛素不敏感，例如高血糖最初就是身体细胞无法对胰岛素完全反应的结果，这种情况被称为胰岛素抵抗。2型糖尿病标记的研究主要是涉及以下方面：1.从基因层面鉴别人群可能患有2型糖尿病的概率；2.在健康和2型糖尿病病人的粪便中筛选糖尿病标记微生物。
2、目前，在ir的研究中，仍然多用老鼠作为实验动物模型，猪则较少被应用。猪是杂食性动物，其在心血管系统、消化系统的解剖学和生理学方面以及糖脂代谢过程与人极为相似。其中，广西巴马小型猪具有体型矮小、易饲养、适应性强、遗传性稳定等特点，是研究与饮食相关心血管代谢疾病模型的理想实验动物。
技术实现思路
1、针对以上问题，本发明提供一种胰岛素抵抗模型的构建方法。
2、本发明通过以下技术方案实现：
3、一种胰岛素抵抗模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
4、(1)广西巴马小型猪分组饲养，分为高脂高糖饲喂ir易感组、高脂高糖饲喂ir非易感组、高脂高糖加益生元饲喂ir非易感组与对照组，饲养时间6～8个月；
5、(2)取样本，对各组进行各自取样本，所述样本包括其胰腺、背最长肌、背部皮下脂肪、空肠、回肠和结肠组织；
6、(3)检测，上述样本通过组织全转录组测序，肠道16s rrna基因测序，肠道、肌肉和血清非靶标代谢组学检测，以及不同组学的关联分析，筛选与胰岛素抵抗相关的表达基因、非编码rna、肠道菌群和代谢物，构成胰岛素抵抗模型。
7、进一步地，连续两次ivgtt试验中60min血糖值≥6.3mmol/l、fbg<6.3mmol/l、且空腹胰岛素和homa-ir值均高于对照组。
8、进一步地，高脂高糖组饲料配比：60％基础饲料+30％蔗糖+10％豆油；高脂高糖饲料诱导广西巴马小型猪的胰岛素抵抗；高脂高糖加益生元组饲料配比：60％基础饲料+30％蔗糖+10％豆油+益生元，益生元的添加量为：体重≤60kg，0.6g/kg体重/次投料；体重>60kg，0.5g/kg体重/次投料；对照组全程饲喂基础饲料。
9、进一步地，所述样本全转录组测序。
10、进一步地，所述全转录组测序的方法包括以下步骤：
11、lncrna和mrna：样品提取总rna后，去除其中的核糖体rna，得到的rna随机打断成为短片段，再以片断化后的rna为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成cdna第一链；接着加入缓冲液、dntps、rnase h和dnapolymerase i合成cdna第二链，经过纯化并加eb缓冲液洗脱经末端修复、加碱基a，加测序接头，然后通过ung(uracil-n-glycosylase)酶降解第二条链，并进行pcr扩增；则建成测序文库，并用illuminahiseqtm 4000进行测序；
12、mirna：用trizol从样本中提取total rna，琼脂糖凝胶电泳切胶选择18-30nt的片段；分别连接3′接头和5′接头，然后对连接了两侧接头的small rna进行反转录和pcr扩增；最后琼脂糖凝胶电泳回收并纯化约140bp的条带，完成文库构建；并使用agilent 2100以及qpcr进行质控，并上机测序。
13、进一步地，lncrna和mrna：对下机的raw reads利用fastp进行质控，过滤低质量数据，获得clean reads；随后将clean reads用hisat2比对到参考基因组(sscrofa11.1)上，并利用stringtie进行转录本组装和定量，得到已知的转录本与新的转录本；利用cpc和cnci两个软件对新转录本进行蛋白质编码能力预测，取其交集作为可靠的预测结果；然后分别对样本中的mrna、lncrna和mirna进行表达量分析以及差异基因的go和kegg富集分析，最后进行lncrna-mirna-mrna的关联分析；
14、mirna：对原始下机数据经过初步过滤得到的小rna数据再进行进一步的过滤，选取genbank中的rrna，scrna，snorna，snrna，trna，来注释测序得到的tag序列；选取rfam(11.0)数据库来注释测序得到的tag序列，尽可能的发现并去除样本中可能rrna，scrna，snorna，snrna，trna；将tag序列比对到已知的参考基因组上，根据比对基因组的结果，以及外显子内含子在基因组上的位置，可以找出来自mrna降解片段的tag序列。
15、进一步地，步骤(3)中，将各饲养组的小型猪背最长肌进行全转录组测序和分析，并鉴定出各饲养组之间的差异表达基因。
16、进一步地，步骤(3)中，通过qrt-pcr验证发现，高脂高糖饲喂ir易感组中lncrnagpd2和与炎症反应密切相关的gpd2表达显著升高，mir-0028-5p显著降低；通过qrt-pcr及race试验确定lncrnagpd2的全长序列，通过干扰、过表达及荧光素酶报告基因检测确认lncrna gpd2、gpd2和mir-0028-5p之间的互作关系，成功构建与ir发生发展相关的lncrnagpd2-mir-0028-5p-gpd2的互作网络。
17、进一步地，步骤(3)中，通过lefse分析高脂高糖加益生元饲喂ir非易感组中的肠道得到saccharimonadales(糖单胞菌目)；通过lefse分析高脂高糖饲喂ir易感组、高脂高糖饲喂ir非易感组得出光冈菌属。
18、进一步地，步骤(3)中，将各饲养组的组织代谢物通过smica-p软件进行pca和opls-da分析，并筛选出显著差异的代谢物；所述差异代谢物包括：
19、glycochenodeoxycholic acid、glycodeoxycholic acid(hydrate)和β-d-glucopyranosiduronic acid,(3α,5β)-24-[(carboxymethyl)amino]-24-oxocholan-3-yl。
20、与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
21、本发明高脂高糖饮诱导法，构建广西巴马小型猪ir模型，能为ir的发病机制提供动物模型。通过全转录组测序筛选出胰岛素抵抗易感性相关的基因和非编码rna，同时利用非靶标代谢组学和微生物16s rrna基因测序筛选出胰岛素抵抗易感性相关的代谢物和肠道菌群，并将不同组学的数据进行关联分析，筛选胰岛素抵抗发生发展相关的生物标记物，为胰岛素抵抗的预防、诊断、药物研发和治疗提供理论依据。
1.一种胰岛素抵抗模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗模型的构建方法，其特征在于：连续两次ivgtt试验中60min血糖值≥6.3mmol/l、fbg<6.3mmol/l、且空腹胰岛素和homa-ir值均高于对照组。
3.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗模型的构建方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗模型的构建方法，其特征在于：所述样本全转录组测序。
5.根据权利要求4所述的胰岛素抵抗模型的构建方法，其特征在于，所述全转录组测序的方法包括以下步骤：
6.根据权利要求4所述的胰岛素抵抗模型的构建方法，其特征在于：
7.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗模型的构建方法，其特征在于：将各饲养组的小型猪背最长肌进行全转录组测序，并鉴定出各饲养组之间的差异表达基因。
8.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗模型的构建方法，其特征在于：通过qrt-pcr验证发现，高脂高糖饲喂ir易感组中lncrna gpd2和与炎症反应密切相关的gpd2表达显著升高，mir-0028-5p显著降低；通过qrt-pcr及race试验确定lncrnagpd2的全长序列，通过干扰、过表达及荧光素酶报告基因检测确认lncrnagpd2、gpd2和mir-0028-5p之间的互作关系，成功构建与ir发生发展相关的lncrnagpd2-mir-0028-5p-gpd2的互作网络。
9.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗模型的构建方法，其特征在于：通过lefse分析高脂高糖加益生元饲喂ir非易感组中的肠道得到saccharimonadales(髌骨细菌门)；
10.根据权利要求1所述的胰岛素抵抗模型的构建方法，其特征在于：将各饲养组通过smica-p软件进行pca和opls-da分析，并筛选出显著的差异代谢物；所述差异代谢物包括：glycochenodeoxycholic acid、glycodeoxycholic acid(hydrate)和β-d-glucopyranosiduronic acid,(3α,5β)-24-[(carboxymethyl)amino]-24-oxocholan-3-yl。
