本发明属于生物医药，公开了一种双基因沉默人工microrna及其应用。
背景技术：
1、目前，手术治疗、化学治疗以及放射治疗等传统方法是主要的治疗方法，而rna干扰(rnai)作为一种基因沉默的重要方法，几乎可以用于调节所有真核细胞内mrna的稳定性和翻译，是一种新型肿瘤治疗策略。rnai主要形式为基因组衍生microrna(mirna)和外源性小干扰rna(sirna)以序列特异性方式靶向细胞内mrna，实现转录后基因调控(naturereviews drugdiscovery,2019,18(6):421-446)。随着研究的不断深入，rnai已被证明是一种稳定且可靠的治疗策略，基于rnai的药物也在不断被开发并应用于临床。一系列mirna药物也在临床试验阶段的研究中，这均预示着现已开启了rnai治疗的新时代。
2、手术治疗、化学治疗以及放射治疗等传统方法是主要的治疗方法，但肿瘤异质性会导致治疗效果不理想，残留的转移灶易致肿瘤复发；新型的内分泌治疗和靶向治疗也是常见方法，但由于需要特定激素受体或靶点，对不同亚型乳腺癌的治疗范围仍有限制。
3、作为rnai作用的主要媒介，mirna较sirna具有明显的优势。sirna介导的rnai要求rna序列与靶序列完全互补，而mirna与靶mrna序列不需要完全互补就可以介导rna i作用；sirna介导的rnai与细胞内部内源性存在的mirna存在竞争细胞因子(如转运子5)的现象，造成体内mirna作用的靶基因表达增强，引起细胞损伤或过度生长。而由mirna介导的rnai，尤其是从内源性mirna改造而来的序列，一般不存在与内源性mirna竞争的关系。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种能够实现双基因沉默的人工改造的microrna，人工改造的microrna以下简称amirna，所述双基因在本发明中指的是肿瘤如乳腺癌中高表达的胰岛素受体底物1即irs1基因和n-乙酰半乳糖氨基转移酶7即galnt7基因，且本发明提供的双基因沉默amirna是以irs1基因和galnt7基因的mrna序列为双靶标设计的，并使用具有同源靶向性肿瘤细胞膜修饰arg-cs离子交联的amirna构建amir@arg-cs@cm以实现基因递送，基于rnai疗法用于肿瘤的治疗。
2、因此，第一方面，本发明提供了一种双基因沉默amirna，所述amirna能够同时靶向并基因沉默两种不同的高表达蛋白对应的mrna。所述双基因沉默amirna，是根据靶mrna的序列设计的，由正义链和反义链退火形成双链，其中，正义链为：5’-nguaaacagucucunnnggngn-3’，其中，n可以为a、g、c、u中任意碱基，反义链与正义链完全互补。双链的amirna分子在细胞质中被组装进rna诱导的沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex,risc)，紧接着amirna中的正义链被降解，反义链或者叫做向导链指导risc识别与结合到与其碱基互补的mrna的相应位点，从而通过复合体中的核糖核酸酶ii剪切靶mrna，从而达到调节靶基因的作用。
3、第二方面，本发明提供了上述双基因沉默amirna在制备调节细胞中irs1基因和galnt7基因功能的药物中的应用，本发明提供的上述双基因沉默amirna可以同时靶向并剪切irs1基因的mrna和galnt7基因的mrna，从而抑制下游蛋白表达，具体的，一方面，amirna剪切irs1 mrna后，irs1蛋白表达下调，抑制胰岛素/ir/irs1/pi3k信号通路，并同时抑制葡萄糖的转运，遏制肿瘤细胞能量来源，共同促进肿瘤细胞凋亡；另一方面，amirna剪切galnt7 mrna后，galnt7蛋白表达下调，抑制细胞膜表面聚糖链形成和高唾液酸化，而且由于葡萄糖是胞内唾液酸合成原料，其摄取减少会降低唾液酸产生，同样减少细胞膜的唾液酸化，协同抑制细胞的迁移和侵袭。总之，本发明提供的双基因沉默amirna能够促进肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞迁移侵袭，协同治疗肿瘤。
4、为了实现上述双基因沉默amirna的纳米化，且作为一种较佳的应用方式，所述应用步骤包括：如图2所示，将上述amirna负载于精氨酸-壳聚糖arg-cs后形成纳米粒amir@arg-cs，为了更进一步的提高药物的肿瘤细胞的靶向性，在所述amir@arg-cs表面再包覆一层同源靶向性肿瘤细胞膜cm，形成靶向纳米复合物amir@arg-cs@cm，当经小鼠尾静脉注射amir@arg-cs@cm后，纳米复合物靶向到肿瘤部位并被内吞入肿瘤细胞，载体生物降解以释放amirna，分别与irs1 mrna和galnt7 mrna碱基互补配对形成risc，并将对应mrna剪切降解。
5、技术效果：
6、本发明第一方面提供的双基因沉默amirna是将两段rna的部分序列整合在一起，即设计的序列与靶标mrna部分互补，在具有较佳识别能力的同时减少了序列长度；mirna一般由21-25个核苷酸组成，该方法可在序列较短的条件下(约22 bp)对两种mrna实现良好的靶向效果。此外，设计的amirna与内源性rna类似，降低了与内源性mirna竞争的可能性；若使用串联序列，长度较长，在哺乳动物细胞中，长dsrna更加容易引发非特异性的干扰素效应即长dsrna引发非特异性的干扰素效应的概率更大。
7、本发明第一方面提供的双基因沉默amirna，相比于串联型基因沉默序列用于rnai治疗，本身即具备更高效、更经济的优势；在精准性方面，本发明通过qpcr和westernblot试验，验证了amirna的双基因沉默效果，可同时靶向irs1和galnt7 mrna，调节下游通路，发挥多种作用；既能抑制肿瘤成长又能遏制细胞迁移，并能实现荷瘤小鼠的肿瘤实体瘤治疗。
8、本发明第二方面提供了所述双基因沉默amirna在制备调节细胞中irs1基因和galnt7基因功能的药物中的应用，使本发明提供的所述双基因沉默amirna能够在生物体内发挥作用。
1.一种双基因沉默人工microrna分子，其特征在于，所述双基因沉默人工microrna分子靶向irs1基因和galnt基因mrna；所述双基因沉默人工microrna分子的正义链的碱基序列如seq id no.1所示，为5’-nguaaacagucucunnnggngn-3’，其中，n可以为a、g、c、u中任意碱基：所述双基因沉默人工microrna分子的反义链碱基序列与正义链完全互补。
2.如权利要求1所述的一种双基因沉默人工microrna分子，其特征在于，所述双基因沉默人工microrna分子的正义链即sense链的碱基序列如seq id no.2所示：5’-uguaaacagucucuacuggagg-3’，反义链即antisense链的碱基序列如seq id no.3所示：5’-ccuccaguagagacuguuuaca-3’。
3.权利要求1～2中任意一项权利要求所述双基因沉默人工microrna分子在制备调节细胞中irs1基因和galnt7基因功能的药物中的应用。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述双基因沉默人工microrna分子负载于精氨酸-壳聚糖arg-cs后形成纳米粒amir@arg-cs，作为调节细胞中irs1基因和galnt7基因功能的药物。
5.权利要求3所述的应用，其特征在于，amir@arg-cs作为调节细胞中irs1基因和galnt7基因功能的药物，浓度范围为0.03mg/ml～0.14mg/ml。
6.权利要求4所述的应用，其特征在于，在所述amir@arg-cs表面再包覆一层同源靶向性肿瘤细胞膜cm，形成靶向纳米复合物amir@arg-cs@cm，作为调节细胞中irs1基因和galnt7基因功能的药物。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，amir@arg-cs@cm作为调节细胞中irs1基因和galnt7基因功能的药物，浓度范围为0.03mg/ml～0.14mg/ml，其中amir的浓度范围为80～300nm。
