调控草莓果实形状的RF基因及其应用

调控草莓果实形状的rf基因及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物技术领域，具体涉及一种调控草莓果实形状的rf基因及其应用。


背景技术：

2.草莓果实色泽艳丽、芳香浓郁、营养丰富，深受广大消费者的喜爱。草莓是低矮草本植株，挂果时间长，集中上市于冬季和早春水果淡季，且非常适用于休闲采摘和都市农业。据统计，近年来我国的草莓栽培面积和产量均居世界首位，是草莓生产大国和消费大国。
3.现代栽培草莓(凤梨草莓，fragaria ananassa，8倍体)果实形状具有一定的多样性，有些形如鸡心，如主栽品种
‘
红颜’、
‘
甜查理’等；有些果形较长，如品种
‘
章姬’等。果实形状是水果品质评价及市场定级的一项重要指标。选育果形优良的草莓新品种仍是当前的迫切需要，尤其是新奇果形品种将具有很强的吸引力。
4.果实是草莓的主要经济部位及食用部位。草莓果实表面有序排列的瘦果是由子房发育而来的，是生物学意义上的果实。而果肉是由花托发育而来的，所以草莓属于假果或聚合果。草莓果实早期发育伴随着生长素和赤霉素合成和信号途径的激活以及两种激素的快速积累。对授粉或未授粉的草莓果实外施赤霉素促进了果实纵向伸长和横向变窄，果形指数显著提高；而外施生长素能够增加果实的宽度，果形指数下降。这些结果表明赤霉素是影响草莓果形指数的关键激素，生长素在其中也发挥了重要作用。
5.但是，目前市场上的草莓还是以短圆锥形、鸡心形为主，果形较为单一。究其原因是对草莓果形调控机理的研究还不够深入，草莓果形调控关键基因还没有得到充分挖掘。草莓中关于果形调控基因的研究鲜见报道，开展果形调控基因发掘工作对于草莓果形育种具有重要的借鉴和指导意义。


技术实现要素：

6.基于此，有必要提供一种调控草莓果实形状的rf基因及其应用，对果实重量没有显著的影响。
7.本发明采用如下技术方案：
8.本发明提供一种调控草莓果实形状的rf基因，所述rf基因的序列如a)和b)所示：a)如seq id no.1所示的dna分子；b)在严格条件下与a)限定的dna序列杂交且编码具有调节果实形状的蛋白的dna分子。
9.本发明还提供上述所述调控草莓果实形状的rf基因所编码的蛋白。
10.本发明还提供一种包含上述调控草莓果实形状的rf基因的表达载体。
11.在其中一个实施例中，所述表达载体为rf基因过表达载体，其构建方法采用如seq id no.2和seq id no.3所示的引物序列。
12.所述调控草莓果实形状的rf基因、调控草莓果实形状的rf基因编码的蛋白或者含rf基因的表达载体在改良作物果实形状或者其它器官形状中的应用。
13.在其中一些实施例中，所述作物为草莓、拟南芥。
14.本发明的有益效果是：
15.本发明首次发现了能够调控草莓果实形状的rf基因，证明对草莓果实重量没有显著的影响且能够调控草莓变圆，还能够调控叶型细长。
附图说明
16.图1为ruegen野生型草莓与突变体rf草莓的表型统计结果；其中，a：ruegen野生型与rf突变体成熟果实表型；b:ruegen野生型与rf突变体10dap果实表型，rf左边果实为中间表型，右边为果实扁圆表型；c：ruegen野生型叶片正反面表型；d:rf突变体叶片正反表型；e:ruegen野生型与rf突变体的果实长度(fruit length)、果实宽度(fruit width)、果形指数(fruit shape index)统计比较；f:ruegen野生型与rf突变体果实(fruit weight)重量统计比较；g:叶型指数(leaf shape index)统计比较；注：标尺＝1cm，**代表t检验p《0.01，ns代表t检验无显著差异。
17.图2为野生型(wt)草莓与突变体rf草莓的果实发育过程的统计图；其中，a：野生型及rf突变体的花朵照片；b：野生型及rf花瓣长宽比(petal shape index)统计图，**代表t检验p《0.01；c：野生型及rf突变体授粉后3d、7d、10d、18d、23d、30d的果形比较照片(注：标尺＝1cm)。
18.图3为野生型草莓与突变体rf草莓的果实细胞形态观测统计；其中，a：野生型及rf突变体22d果实细胞切片观察；b：野生型及rf突变体22d果实细胞长(cell length)、细胞宽(cell width)及长宽比统计；注：标尺＝250μm，**代表t检验p《0.01。
19.图4为突变体rf草莓的致突变基因的定位及其表达模式；其中，a：rf基因的结构及突变位点；b：rf基因的表达模式。
20.图5为rf-oe过表达株系的获得及表型观察；其中，a：野生型和rf-oe的3个株系的莲座叶时期表型；b:rf-oe的3个株系(l20、l25、l27)的表达量测定；c：茎生叶时期野生型拟南芥与rf-oe株系表型；d：野生型和rf-oe株系茎生叶和荚果表型；e：野生型和rf-oe株系的花及花药、花瓣、花柱的表型；f：野生型和rf-oe 7d幼苗表型及下胚轴、根长统计；g：野生型和rf-oe种子的表型及长宽比统计；h：野生型和rf-oe根尖细胞观察；注：标尺＝1cm；**代表t检验p《0.01。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
22.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
23.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
24.1、试验材料来源及生长条件
25.yellow wonder(yw，白果，长圆锥形果形)草莓材料：national germplasm repository id pi641092，参考文献slovin,j.p.,schmitt,k.,and folta,k.m.(2009).an inbred line of the diploid strawberry fragaria vesca f.semperflorens for genomic and molecular genetic studies in the rosaceae.plant methods 5:15。
26.ruegen(红果，长圆锥形果形)草莓材料：购买于the strawberry store(http://thestrawberrystore.com)。参考文献sun j,liu x,yang t,slovin j,chen p.profiling polyphenols of two diploid strawberry(fragaria vesca)inbred lines using uhplc-hrms(n.).food chem.2014mar 1；146:289-98.doi:10.1016/j.foodchem.2013.08.089.
27.突变体rf(ems诱变产生，为yw背景)草莓材料：申请人实验室通过筛选获得的人工突变材料。
28.野生型拟南芥(arabidopsis thaliana)材料是哥伦比亚(columbia)生态型：购买于abrc种子库，网址https://www.arabidopsis.org/。
29.用于实验的材料均在温度为22℃，光照为100μmol m-2
s-1
，光周期为16h light/8h dark的植物培养间中生长。
30.2、突变体表型研究
31.发明人研究团队通过ems人工诱变森林草莓野生型yw，在m2群体中筛选获得了一株果形显著变圆的突变体round fruit(rf)，同时其果重、株形均没有明显改变。为了便于观察草莓果实成熟期，将yw5af7(白果)背景下的rf突变体与ruegen(红果)杂交以获得红果背景下的突变体，以下均以红果背景材料进行试验统计。草莓果实相关的长、宽、果形指数、果重等统计均选用充分授粉的完熟果实，草莓叶型统计选用长势中庸的三出复叶。具体统计结果见图1。
32.进一步授粉观察发现，rf突变体果实在授粉前直到30d果实成熟的整个发育时期，其花托形态均相较ruegen野生型果实显著变圆。此外在二者花瓣形态指数也存在显著差异，突变体的长宽比显著减小。这种现象在萼片上也同样可以明显观察到。统计结果见图2。
33.3、草莓果实切片观察
34.选用授粉22d的野生型草莓和rf突变体草莓的果实，石蜡切片后接希夫试剂(schiff reagent)染色法，荧光正置显微镜观察拍照，具体步骤如下：
35.(1)固定液faa配制(1l用量):福尔马林100ml、乙酸30ml、50％乙醇870ml，现用现配，且避光保存；
36.(2)取样：分别取授粉22d的野生型和rf突变体的果实置于装满faa固定液的蓝盖瓶中，抽真空30min，室温24h，4℃过夜；
37.(3)脱水：除去组织中的水分，使细胞组织变硬，也便于透明剂进入细胞内。将样品依次置于30％乙醇(1.5h)、50％乙醇(1.5h)、70％乙醇(1.5h)、85％乙醇(1.5h)、95％乙醇(1.5h)、100％乙醇(1h)、100％乙醇(1h)中进行梯度脱水，且每次脱水前都抽真空20min，其中样品可在70％乙醇中长时间保存。
38.(4)透明：使透明剂二甲苯进入组织内，以便使石蜡透入组织。1/5二甲苯 4/5乙醇(1h)-2/5二甲苯 3/5乙醇(1h)-3/5二甲苯 2/5乙醇(1h)-4/5二甲苯 1/5乙醇(1h)-纯二甲苯(1h)-纯二甲苯(1h)。在装有材料的蓝盖瓶上画五格刻度线，每次吸出一小格的乙醇二甲
苯混合液后加入一小格的纯二甲苯，直至瓶内变为纯二甲苯。
39.(5)透蜡：由低浓度到高浓度，即将二甲苯吸出，仅剩没过材料的二甲苯，加入碎蜡至瓶满，碎蜡一完全融化，再加入碎蜡，直至瓶满。由低温到高温，即37℃(30min)、42℃(30min)、60℃(3-5d)，此过程越慢透蜡效果越好。
40.(6)纯蜡透蜡：换用纯蜡继续透蜡，换纯蜡3次，每次2h，60℃水浴；
41.(7)包埋：包埋机提前一小时打开，让蜡融化。包埋时材料方向一致，做好标记，底部的蜡多一点，包埋后1-2d再准备下一步切片。
42.(8)切片：修蜡后切片，厚度10-16μm。摊片温度37℃，展片后及时用载玻片捞，置于37℃烘干(48h)；
43.(9)脱蜡：将样品在纯二甲苯脱蜡2次(每次1h)后，再置于二甲苯与无水乙醇1：1的溶液中继续脱蜡10min；
44.(10)自来水冲洗2-3min，再用蒸馏水浸洗2次；
45.(11)切片入过碘酸溶液，室温放置5-8min，一般不宜超过10min；
46.(12)自来水冲洗1次，再用蒸馏水浸洗2次；
47.(13)切片入schiff reagent，室温阴暗处浸染10-20min；直到切片被染成红色或紫红色；
48.(14)自来水冲洗后上荧光正置显微镜观察并拍照。
49.统计结果见图2及图3：切片观察发现野生型草莓果实细胞呈细长形态，延伸方向与果实纵轴平行。而突变体rf草莓果实髓心细胞显著变圆，故rf果实变圆是果实细胞在发育过程中极性减弱导致的。
50.4、致突变基因的定位
51.在森林草莓ems突变体库中发现rf突变体后，首先以rf突变体为母本，以野生型森林草莓ruegen为父本进行回交获得bc1f1代群体，然后将bc1f1代群体进行自交后获得bc1f2代群体，在bc1f2代群体中出现性状分离，分离出rf突变体以及野生型表型的森林草莓。
52.分别取bc1f2代群体中11株rf突变体以及20株野生型表型森林草莓的叶片等量混合后，并分别采用ctab法提取基因组，检测基因组dna质量达标后，委托上海派森诺生物科技有限公司采用illumina hiseq x ten平台进行双末端建库测序。获得测序数据后，通过生物信息学分析，定位到致突变基因，见图4。
53.通过基因定位，发现突变体rf草莓的致突变基因为gene20276(annotation ver1.1)/fvh4_2g22810(annotation ver4.0)，该基因只包含4个外显子，3个内含子。fvh4_2g22810的第797个碱基发生了c到t的突变，形成终止密码子，蛋白翻译提前终止，由于提前终止位于第二个外显子比较靠前的区域，可导致蛋白失去原有功能。
54.为了验证该突变位点的准确性，选取回交f2群体中圆果表型植株分别提取基因组dna并进行pcr检测。共检测52个圆果单株，发生在fvh4_2g22810的snp均为纯合突变，说明该snp与圆果表型连锁。
55.》rf基因序列(无下划线序列为外显子，下划线序列为内含子)：
56.atgacgactgggatggttcaagatcagcagaaccttgagaaacagatggggtgcatggccggcttgcttcagatcttcgatcgccaccagattctctccggcaaacgcctctactccactaaacgccttccttcctcggcggtgagtttgaaaacgaaatactcatattattattcggctcaatgtaccaacaaatttcaatgtgttgtgtattgatatc
tgtttgatttgttttgtttctcaggctatggtggcgtcgtcaccggagccgtcgtccaacgtatcgccggagacatcaaaggagttggaaaagcaaccaccgcaaaacaaatccctgccttcacccgacaggttgaacttgaagcagtctccatcggcgtcggagctccgatctcctttaccggagccgaggacgccgacggccgaatcgccttatccgaaatctccgcttcctcttccggttttcgaattcaaagaaggcacgaggtcgtcgtggaagttttcgagagacatgccgcggctctcgctcgatagcagggccacagtggacgccaaaggaagcctttacccgaaggagatccgaaccaacgccgcgatattgtccgccaaccgaagcgtgaactccggcgaggatggagacaagaatcaccgctcgcctagcgtcattgcgaggctaatgggactggaaccgttaccgcaatcggatcctgaaccgatcaagctccggagatcggcttccgagtcgagagtgaacagagatctgtaccagccacggtctaacgataacaataatttccaggcaaggcaaccgcagcaagagaattcgaagagcaatgtttccggcaatgtaggcaataaagagcaccggagctccaatggtagacaggtagatccgaaggcttacaatgtgaaagctcaaaacaggggaatggtgcagaggaagagcttctttgactcggcggattttttcccggagccgaaacagtccatttcggtttacggcgagattgagaagcggctgaggatgagaggcattgatgaaccgtctaaagatttggagacattgaagcaaatcctggaagcgttacagctcaaaggtcttcttcactcccggaaatcatcgtcgtctccccaaatcaactcccgaaacttcgtctacgaccggttcgcggagtcgccaattgtggtgatgaggccgtccagatcgccgagttccactaaccgagccgccagattcggcaacgaatcgccgccttcgagtttccggtcaagagctgcagctcaccggaattcgaatcccggcggcgagacgtatcagacggcgagcccaaggcgtgagcggccggagaatgtgcggagccagagcagaggtagaagtccgaacccgctgaccaggagcgagaatggcgtgaggagtccgagtcggagaggcccattagtgatcgagacgcatagaaaaggaaacagcgatccagtggagcacaggagagtctctccggttcactctcccaaggttagttcaagacggtcggtctcagatcaaccaatgaccaatcgttcacccagggtcaagaaaccaacggcggagatcacacccaaggaggaaaaaataaccatccacagagcagaggatgattcctccaccatgtccgagagtagcattagtaatagtacttcttcacaaaccgacactgaggtaacttaattagtcattcattttcttttgataatttttaagtgtaatcagttaggcgatattagttgttcgggattttattaacggaatgagatgaattttattgtagagatggaaggtggaggagtacaaagaagggaggagtctattggagaggtgtgacaagctactacacagcatagccgagttgcaaccgagtccggtctccgttctcgactcgtcgttttacaaagaggaatcttcaccctcgccagtgatgaagcgcagcattgatttcaaaggtaattgggccacttcttcttccccaacattaacacactgccacacaaaagacagactgccatttttgtttgtttaagcagcagctctgtggtctggtcttccttccagtttcagagagattttgattgcttacagtttgcgatttttaacctaatcggtgacgtcttacagtcttaggccccccccctgttcccagcccttctacccttcataggtttactggtactgcaccactgcctggggttgtggaacttgtggggatagataggtatcctctgcactttctgccacagtgaatatatctagtaatgtctttaacgccaattaatcctgtccacgtcattcactcccaaatttggaccctcccagcgcacagatttaatgctttaaaaaatgttacatttcacacgtggttggtttccattgattagctgtgacataaacagggaaataggtccgtggtacagtagtcacggagtaggatacactttctgatggcgatgctcggggtagggagctggaaaacgacaccgttttccggtcaagatcgaattgatgaaccctaactgtaatccatgacaatgacccacttgcaactacagctgctaaatttgattgtccattatctacgtgtctacaatttcgaccggtgggtttaattatttgattttaattttcggtttgatgaaacaggtgagatggtagatatttgggggcagccaatctgcggaaacgagtcggaatccgacgactctgattttgtctacgtttccgagattctccgagctttgaattacttaccggaagactccgacattttctcattgctggagaagcagcaagagctcaaggggaaagacacttctcgagtttcgacactcgagaggaggctcatcttcgacattatcacaaaaattatcgaccgcaaccggcaattgccgccgtggaaggcagtgtcacggcagacttcggtgccggaaatctggtcggagtttcggagaatccgggtgagggatgaatcggaggatttgtttgaagtcatatgcggagtattgaagaaggaccttgcagaggacgcaataaacgggtggggagactgttccgtcgaaatgtccgacgccgttttggacattgaacgcctcatcttcaaggacttgatcggcgaaacgatccgagatctcgcttctatttccccgaattccggta
gagttgcggcgctttgtaggaagttggtcttctga(seq id no.1)
57.对该基因的表达模式分析发现，该基因广泛表达在草莓各个组织中，在果实相关的组织中表达较高。
58.由上述试验结果可看出：与野生型草莓相比，突变体rf草莓果实长度减小、宽度增加，果形指数由野生型的1.6左右下降到0.7，呈近圆形或扁圆形。但其果实重量却没受到显著影响，说明该突变体果形的改变并不影响草莓的产量。除此之外，草莓叶片也出现明显变圆，叶型指数显著下降，但其植株整体无明显改变。rf突变体的表型暗示着该突变体的致突变基因在果形调控上具有特异性。
59.5、构建rf基因的过表达载体及拟南芥的稳定转化
60.通过生物信息学分析，定位到致突变候选基因后，构建rf基因的过表达载体。首先，根据定位基因的编码序列，在候选基因rf的两侧分别设计正反引物，并在引物两端加上pri101载体的接头序列，扩增引物(小写字母为接头序列，大写字母为基因引物序列)为：
61.rf-sal1-f:
62.ttgatacatatgcccgtcgacatgacgactgggatggttcaag(seq id no.2)
63.rf-kpn1-r:
64.tggaaaagggaattcggtaccgaagaccaacttcctacaaagcgc(seq id no.3)
65.以野生型yw的dna为模板，用高保真酶phanta扩增基因组dna全长，约3.3kb；选用sal1、kpn1双酶切线性化载体pri101，通过同源重组反应将目的片段与线性化载体连接，将连接产物通过热激的方式转入大肠杆菌感受态细胞trans5α，将复苏后的菌体涂于含有抗生素的固体lb培养基(lb kna 50μg/ml)上，筛选阳性单克隆，扩繁后提取重组质粒，经酶切和测序鉴定正确的重组质粒热激法转入农杆感受态gv3101中，复苏后收集菌体并涂在含有抗生素的固体lb培养基(lb gent 50μg/ml，rif 50μg/ml，kna 50μg/ml)上筛选，长出单克隆，进行pcr验证，与甘油混合-80℃保存备用。
66.将候选基因rf超表达载体的阳性农杆菌菌液重新复苏，并通过浸花法稳定转入野生型拟南芥中，具体步骤如下：
67.(1)蘸取-80℃保存的菌液于含有对应抗性的固体lb培养基(lb gent50μg/ml rif 50μg/ml kna 50μg/ml)上，划线活化农杆菌，28℃培养2-3d后，挑取单克隆放于4ml含有抗性的液体lb培养基(lb gent 50μg/ml rif50μg/ml kna 50μg/ml)中，28℃震荡培养12-16h，pcr鉴定阳性菌液。
68.(2)取1ml阳性菌液加到100ml含有抗生素的液体lb(lb gent50μg/ml rif 50μg/ml kna 50μg/ml)培养基中，28℃，250rpm震荡培养16-20h。
69.(3)将菌液5000rpm离心6min收集菌体，并重悬于侵染缓冲液(无菌水 50g/l蔗糖，silwet l-77 400μl/l，6-ba 20μg/l)中。
70.(4)选取生长一个月左右，生长状况良好，花苞多并且刚露白时的拟南芥植株，转化前浇足水，将其花苞全部浸于重悬液中40-60s，将植物平放并遮光24h后扶起，转到正常条件下生长。
71.(5)将t1代种子铺于经高压灭菌的ph为5.8的1/2ms(m5524，sigma aldrich)培养基(1/2ms kna 100μg/ml)上筛选阳性植株，4℃春化3-5d后转到白光下生长，见光后6d左右将能观察到荧光的抗性小苗移到土中继续生长。
72.(6)转基因阳性植株鉴定：
73.将能观察到绿色荧光的转基因植株，取叶片，单株提取基因组dna，并以此为pcr模板。pcr检测能扩增出正确大小条带的植株即确认为阳性转基因植株。所用的鉴定pcr引物：
74.trm5-f:atgacgactgggatggttcaag
75.trm5短-r:tagttccaagaagaaactgagaat
76.(片段大小为500bp左右)
77.(7)表型统计：
78.拟南芥苗期、莲座叶时期、茎生叶时期表型统计分别选用t1代萌发7d、25d、40d后的幼苗，拟南芥种子形状指数统计选用t2代种子。统计结果见图5。
79.通过将含有rf基因的过表达载体稳定转化到拟南芥中获得3个稳定转化株系(l20、l25和l27)，rf基因过表达(rf-oe)的3个拟南芥株系莲座叶均变得细长，并且表达量越高的株系细长表型越严重，rf表达水平与表型正相关。茎生叶时期rf-oe的茎秆更加细长，但植株高度却低于野生型，猜测是长势较弱导致。rf-oe的茎生叶显示与莲座叶类似的细长表型，荚果也显著长于野生型。对拟南芥的花器官观察发现rf-oe的花药、花瓣、花柱等器官均相较野生型变得细长，但花器官的数量却保持一致。总的来说，rf过表达载体导入到拟南芥中导致了拟南芥的地上部分的器官均变得细长。通过比较t2代种子观察发现，rf-oe的种子显著长于突变体，对发芽7d的野生型与rf-oe幼苗的下胚轴及根长进行统计显示，rf-oe幼苗与野生型拟南芥的下胚轴长度无显著差异，根长则显著长于野生型。显微镜下观察rf-oe与野生型拟南芥的根尖形态差异，发现细胞变得更加细长是导致rf-oe的根相对野生型更加细长的原因。
80.通过将rf基因过表达到哥伦比亚生态型拟南芥中，大部分器官产生了与突变体rf草莓相反的表型。
81.在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。