本发明属于荧光染色，具体涉及一种基于荧光共振能量转移的多色妇科荧光染色液及其制备方法与应用。
背景技术：
1、阴道炎(vaginitis)是目前妇科临床最常见的炎症疾病，根据致病菌的不同可分为真菌性阴道炎、细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎以及需氧菌性阴道炎，细胞溶解性阴道炎和混合性感染等。其中，细菌性阴道炎、真菌性阴道炎和滴虫性阴道炎这三种常见的阴道炎症占所有阴道感染的83％-87％。
2、真菌性阴道炎(vvc)又称为霉菌性阴道炎，主要由白色念珠菌引起。念珠菌通常是一种腐败物寄生菌，可生活在正常人体的皮肤、黏膜、消化道或其他脏器中，在阴道中存在而经常无症状。当阴道糖原增加、酸度升高时，或在机体抵抗力降低的情况下，便可成为致病的原因。细菌性阴道炎(bv)是一种由于阴道菌群失调，乳酸杆菌含量降低使加德纳菌和厌氧菌等其他病原体大量繁殖而造成的混合感染，患者症状多为白带增多、异味、伴有轻度外阴瘙痒或灼烧感。滴虫性阴道炎(tv)由阴道毛滴虫引起，毛滴虫能够寄生于人体泌尿生殖系统、肠道和口腔内。在人体泌尿生殖系统功能紊乱时，滴虫能够大量繁殖，当环境ph更接近中性或碱性时进一步加重感染和炎症反应。
3、半数以上阴道炎患者的生活会受到病症的影响，主要表现为白带增多、异味、伴有轻度外阴瘙痒或灼烧感。孕期，细菌性阴道炎会增加女性早产、宫内胎儿死亡、羊水感染、流产后和产后感染的风险；非孕期，相关细菌可能导致宫颈炎、子宫内膜炎甚至输卵管不孕或宫颈癌症等疾病产生。
4、除炎症本身的症状外，阴道炎往往还会诱发例如盆腔炎和肾周炎等其他疾病，甚至导致女性不孕不育。而临床诊断中往往存在许多错检和漏检，因此我们亟需一种高准确率的阴道炎快速检测方法。目前实验室和临床常用阴道炎检测方法主要有直接镜检法、革兰氏染色法、培养法、荧光pcr法和荧光染色法。直接镜检法能够快速完成对阴道分泌物的检查，但对操作人员能力要求高，容易造成错检漏检；革兰氏染色法相对准确，且较为简单快速，但其操作繁琐，无法满足临床大量样本的快速诊断；培养法能够对不同类型阴道炎的致病菌进行分离和分型检测，且特异性等均高于革兰氏染色法，但其培育时间长，对实验室净度要求高，因此临床较少采用；荧光pcr法具有更准确的物种分辨能力，但对技术、费用要求较高；荧光染色法的特异性较高，技术要求低，且检测结果准确度较高，因此采用荧光染色法诊断阴道炎具有非常大的潜力。
5、现已投入市场应用的妇科荧光染色液大部分以吖啶橙作为荧光素，对不同致病菌的鉴别仍需结合生物形态，难以直接进行阴道炎类别判读；吖啶橙对样本中复杂的基质均有染色，背景荧光较强，对操作人员要求较高。基于吖啶橙的染色液需要蓝光激发，长期使用蓝光会对操作人员眼睛造成负担，且该染色液在光照射一定时间后淬灭严重。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于荧光共振能量转移的多色妇科荧光染色液及其制备方法与应用。
2、本发明的技术方案如下：
3、一种多色妇科荧光染色液，组成如下：0.001～2％蓝色荧光染料、0.001～1％黄/绿色荧光染料、0.001～1％红色荧光染料、0.1～5％保湿剂、1～15％通透剂、0.5～1.5％促溶剂、0.05～2％防淬灭剂、0.01～0.5％防腐剂，溶剂为ph＝4.0-6.0的缓冲溶液；
4、以上百分数均为质量百分数。
5、蓝色荧光染料选自香豆素及其衍生物、alexa fluor 350、dapi、hoechst 33258中的一种或几种，含量优选0.005～0.2％。
6、黄/绿色荧光染料选自吖啶橙、fluorescein(fitc)、sybr gold、sybr green i、sybr green ii中的一种或几种，含量优选0.005～0.1％。
7、红色荧光染料选自碘化丙啶及其衍生物、percp-cyanine5.5、gel-red、cy5、溴化乙锭及其衍生物中的一种或几种，含量优选0.005～0.1％。
8、保湿剂选自甘油、山梨醇、丙二醇、季戊四醇中一种或几种，优选甘油，含量在0.1～5％。
9、通透剂选自吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、曲拉通x-100、二甲基亚砜中的一种或几种，优选二甲基亚砜，含量优选1～10％。
10、促溶剂选自水杨酸、koh、kcl、nacl、naoh中的一种或几种，优选水杨酸、koh、nacl中的一种或几种，含量优选0.5～1.0％。
11、防淬灭剂选自柠檬酸钾、l-抗坏血酸、醋酸钠中的一种或几种，优选柠檬酸钾，含量优选0.05～1％。
12、防腐剂选自多聚甲醛、proclin300、山梨酸及其盐类、苯甲醇中的一种或几种，优选多聚甲醛，含量优选0.01～0.2％。
13、缓冲溶液选自碳酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液中的一种或几种，优选磷酸盐缓冲溶液。
14、本发明所述多色妇科荧光染色液的制备方法为：按照配方，将各原料均匀溶解于缓冲溶液中，即得。
15、本发明所述多色妇科荧光染色液可用于检测妇科分泌物样本中的微生物。具体方法如下：棉签涂抹待测样本洗脱液于载玻片上，滴加本发明荧光染色液，盖上盖玻片，吸去多余染液，即可置于荧光显微镜下观察。
16、本发明的技术原理包括：
17、本发明基于荧光共振能量转移原理，开发一种在365nm紫外光激发下，含蓝色、黄绿色和红色等荧光染料的多色妇科荧光染色液。荧光显微镜下，真菌呈蓝色荧光，细菌呈红色荧光，白细胞及上皮细胞细胞核呈桔色荧光，上皮细胞胞质呈绿色荧光。荧光色彩更丰富，各病原体区分度更高，更有利于临床上对不同类型阴道炎进行快速准确诊断。根据镜下染色液对真实妇科样本的成像效果和染色液光谱表征，探究荧光染料含量、保湿剂、通透剂及抗淬灭剂对染色结果的影响，最终获得染色性能和稳定性良好的多重荧光染色液。
18、荧光共振能量转移即当供体的发射光谱与受体的激发光谱有足够的光谱重叠时，供体分子的激发态能量可以通过非辐射的偶极相互作用传递给受体分子，使供体的荧光强度降低，而受体的荧光强度增加。图1、图2、图3为三种荧光染料的荧光光谱图，由图可知，受体发射光谱与供体激发光谱均有重叠。图1为黄/绿色荧光染料的荧光光谱图，由图可知，其激发波长范围为432-502nm，当采用该范围内的光激发时，该染料的荧光亮度会有大幅度提升，且其最佳发射波长为547nm，呈绿光荧光；图2为蓝色荧光染料的荧光光谱图，由图可知，其激发波长为348nm，属于紫外光波段，最佳发射波长为481nm，呈蓝色荧光；图3为红色荧光染料的荧光光谱图，由图可知，其最佳激发波长为481nm，最佳发射波长为632nm，呈红色荧光。
19、在365nm紫外光激发下，本发明多重荧光染色液对复合真菌及细菌性阴道炎样本染色。上皮细胞：形态为多边形，胞质本身呈黄绿色荧光，细胞核为亮桔色荧光。白细胞：为双核近圆形，整体呈亮粉桔色，大小与上皮细胞的细胞核相近。白色念珠菌(真菌)：圆形或椭圆形，形成菌丝时呈长条状，细胞壁呈蓝色。细菌：菌体较小，高倍视野下可见红色荧光的点状或团状集聚，散落在背景中，形态边界清晰可见。该型号染色液背景几乎无荧光，信噪比较高，同时能够产生三色荧光，使得不同类型微生物呈不同色荧光，降低了临床诊断的判读难度。
20、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
21、(1)本发明的多色妇科荧光染色液基于荧光共振能量转移原理，在365nm紫外光激发下，能够将不同致病菌染成不同颜色，染色后，真菌呈蓝色荧光，细菌呈红色荧光，白细胞及上皮细胞细胞核呈桔色荧光，上皮细胞胞质呈绿色荧光。达到荧光色彩更丰富，各病原体区分度更高的目的，更有利于临床上对不同类型阴道炎的快速诊断。
22、(2)本发明的多色妇科荧光染色液只需一滴即可判别主要微生物种类，操作简单快速，对操作人员技术要求低，且对染液储存条件要求低。
23、(3)本发明的多色妇科荧光染色液对样本染色只需1s左右，能够同时对真菌、细菌、白细胞和上皮细胞进行判别，染色快速且阳性漏检、错检率低，适合临床大批量开展检测鉴别工作。
24、(4)本发明的多色妇科荧光染色液结果稳定可靠，真菌、细菌、白细胞和上皮细胞细胞核及细胞质的形态、结构清晰，对比鲜明。
1.一种多色妇科荧光染色液，其特征在于，组成如下：0.001～2％蓝色荧光染料、0.001～1％黄/绿色荧光染料、0.001～1％红色荧光染料、0.1～5％保湿剂、1～15％通透剂、0.5～1.5％促溶剂、0.05～2％防淬灭剂、0.01～0.5％防腐剂，溶剂为ph＝4.0-6.0的缓冲溶液。
2.如权利要求1所述多色妇科荧光染色液，其特征在于，组成如下：0.005～0.2％蓝色荧光染料、0.005～0.1％黄/绿色荧光染料、0.005～0.1％红色荧光染料、0.1～5％保湿剂、1～10％通透剂、0.5～1.0％促溶剂、0.05～1％防淬灭剂、0.01～0.2％防腐剂，溶剂为ph＝4.0-6.0的缓冲溶液。
3.如权利要求1或2任一项所述多色妇科荧光染色液，其特征在于，蓝色荧光染料选自香豆素及其衍生物、alexa fluor 350、dapi、hoechst 33258中的一种或几种；黄/绿色荧光染料选自吖啶橙、fluorescein(fitc)、sybr gold、sybr green i、sybr green ii中的一种或几种；红色荧光染料选自碘化丙啶及其衍生物、percp-cyanine5.5、gel-red、cy5、溴化乙锭及其衍生物中的一种或几种。
4.如权利要求1或2任一项所述多色妇科荧光染色液，其特征在于，保湿剂选自甘油、山梨醇、丙二醇、季戊四醇中一种或几种。
5.如权利要求1或2任一项所述多色妇科荧光染色液，其特征在于，通透剂选自吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、曲拉通x-100、二甲基亚砜中的一种或几种。
6.如权利要求1或2任一项所述多色妇科荧光染色液，其特征在于，促溶剂选自水杨酸、koh、kcl、nacl、naoh中的一种或几种。
7.如权利要求1或2任一项所述多色妇科荧光染色液，其特征在于，防淬灭剂选自柠檬酸钾、l-抗坏血酸、醋酸钠中的一种或几种。
8.如权利要求1或2任一项所述多色妇科荧光染色液，其特征在于，防腐剂选自多聚甲醛、proclin300、山梨酸及其盐类、苯甲醇中的一种或几种。
9.如权利要求1或2任一项所述多色妇科荧光染色液，其特征在于，缓冲溶液选自碳酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液中的一种或几种。
10.如权利要求1所述多色妇科荧光染色液用于检测妇科分泌物样本中的微生物的应用。
