本发明涉及荧光检测领域，具体涉及一种萘酰亚胺类荧光传感器分子，其制备方法和在检测肝素方面的应用，同时该荧光传感器分子可在结合肝素后用于鱼精蛋白的检测。
背景技术：
1、肝素(heparin，hep)是糖胺聚糖(gag)的主要成分之一，由1-4个连接的吡喃糖基葡糖醛酸和2-氨基-2-脱氧葡萄糖残基组成。作为一种带负电荷、线性、高度硫酸化的复合多糖，肝素能与阳离子蛋白结合，并参与细胞生长、粘附、细胞增殖、炎症和凝血等许多生理过程。在医学治疗中，hep通常被用作抗凝药物，通过高结合亲和力灭活抗凝血酶等凝血因子，但过量服用hep可导致出血或血小板减少等并发症。在疾病的鉴别诊断中，gags可覆盖尿路的移行上皮细胞，使细胞免受病原体和致癌物质的粘附。尽管hep存在于细胞外基质或细胞表面，但尿液中排出的hep主要由gag分解产生，其含量与膀胱肿瘤、感染和其他疾病的发生有关。鉴于上述临床应用，无论是在手术或抗凝过程中使用的剂量，还是在肿瘤和感染等疾病的诊断方面，hep的检测都至关重要。
2、鱼精蛋白(protamine，prtm)是一种带正电荷的强碱性蛋白，在生物医学中，通常可以通过静电吸附与带负电荷的肝素结合，用作肝素过量时的拮抗剂。这使得对于肝素和鱼精蛋白的可逆性检测也十分重要。
3、在众多检测hep的方法中，活化部分凝血活酶时间(aptt)、活化凝血时间(act)和电化学检测法是较为常见的方法，但这些方法存在许多不足：成本高、需要集中实验室设备的支持，而且仅适用于高剂量的hep。与传统检测技术相比，小分子荧光传感器检测法因其操作简单、反应速度快、选择性好、灵敏度高等优点而备受关注。然而，目前报道的荧光传感器在设计上仍不可避免地存在一些局限性，如检测限低、激发和发射波长短等，因此在传感器的设计策略上仍面临着困难。
4、综上所述，开发用于肝素检测的具有长发射波长、选择性好、灵敏度高的荧光传感器仍然是一个挑战。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型的萘酰亚胺类荧光传感器分子，可用于肝素(hep)和/或鱼精蛋白的快速准确检测。
2、本发明还提供了能够延长发射波长、选择性良好、灵敏度高、稳定性好、定性定量检测，并且检测方法简便。
3、在荧光传感器的结构设计中，本发明采用了将4-溴-1,8-萘酰亚胺荧光团与刚性结构哌嗪结合构成光诱导电子转移(pet)机制的精选结构，再通过与另一种荧光团结合构建高效共振能量转移(fret)机制来规避因激发/发射波长相对较短导致传感器不适宜在生物组织中应用的缺陷，得到新型的荧光传感器。
4、本发明第一个方案为：一种萘酰亚胺类荧光传感器分子，具有式(ⅰ)所示的结构，
5、
6、其中x选自f、cl、br或i。优选的，x选自br或i。
7、式(ⅰ)所示的荧光传感器的制备方法为，由式(ⅱ)所示化合物与式(ⅲ)所示化合物反应而得到荧光传感器分子。
8、
9、其中x选自f、cl、br或i。优选的，x选自br或i。
10、式(ⅰ)所示荧光传感器的化学名称为1-苄基-4-(1,3-二氧代-6-(4-(2-氧代-2h-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-1h-苯并[de]异喹啉-2(3h)-基)吡啶-1-卤化鎓。在本发明中也命名为“nap-co-t1”。
11、其中，当x为br时，式(ⅰ)所示荧光传感器的化学名称为1-苄基-4-(1,3-二氧代-6-(4-(2-氧代-2h-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-1h-苯并[de]异喹啉-2(3h)-基)吡啶-1-溴化鎓，在本发明中也命名为“nap-co-t2”；当x为i时，式(ⅰ)所示荧光传感器的化学名称为1-苄基-4-(1,3-二氧代-6-(4-(2-氧代-2h-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-1h-苯并[de]异喹啉-2(3h)-基)吡啶-1-碘化鎓，在本发明中也命名为“nap-co-t1-b”。
12、式(ⅱ)所示化合物的化学名称为6-(4-(2-氧代-2h-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-2-(吡啶-4-基)-1h-苯并[de]异喹啉-1,3(2h)-二酮，在本发明中也命名为“nap-co”。
13、式(ⅲ)所示化合物为苄基卤代烃，在本发明中也命名为“hmb”。其中，当x为br时，式(ⅲ)所示化合物的化学名称为溴化苄，在本发明中也命名为“hmb-br”；当x为i时，式(ⅲ)所示化合物的化学名称为苄基碘，在本发明中也命名为“hmb-i”。
14、上述荧光传感器nap-co-t1的制备方法中：
15、优选的，式(ⅱ)所示化合物(nap-tpa)与式(ⅲ)所示化合物(hmb)的摩尔比为1∶2～1∶5。
16、优选的，反应在惰性气体保护下，在乙腈溶剂中进行。
17、优选的，所述反应在回流条件下进行。
18、在进一步优选方案中，以4-溴-1,8-萘二甲酸酐为起始原料可制备得到化合物nap-p，包括以下步骤：(a)4-溴-1,8-萘二甲酸酐与4-氨基吡啶反应得到化合物nap-b；(b)化合物nap-b与哌嗪反应得到化合物nap-p。
19、
20、化合物nap-b的化学名称为6-溴-2-(4-吡啶基)-1h-苯并[de]异喹啉-1,3(2h)-二酮。
21、化合物nap-p的化学名称为6-(哌嗪-1-基)-2-(吡啶-4-基)-1h-苯并[de]异喹啉-1,3(2h)-二酮。
22、上述化合物nap-b的制备方法中：
23、优选的，步骤(a)4-溴-1，8-萘二甲酸酐与4-氨基吡啶的摩尔比为1∶1～1∶3，回流反应。
24、优选的，步骤(b)nap-b与哌嗪的摩尔比至少为1∶1，并在乙二醇单甲醚中进行回流反应。
25、
26、上述化合物nap-co的制备方法中：
27、优选的，化合物nap-p和香豆素-3-羧酸比为1∶1～1∶2。
28、优选的，反应在缩合剂edci、酰化催化剂或活化剂dmap的存在下进行。
29、优选的，反应温度为0-5℃，反应时间为3-4小时。
30、本发明制备的荧光传感器nap-co-t1、中间体nap-co均通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱(hr-ms)进行了结构确证，证明具有式(i)、(ii)结构。
31、研究表明：405nm激发条件下，单独nap-co-t1溶液仅有微弱的荧光发射；当nap-co-t1溶液中加入肝素后，在565nm处的荧光发射强度明显增强，并且荧光响应时间仅5s，响应之后至少30min内都可以保持高强度的荧光发射；而当nap-co-t1溶液中加入透明质酸钠、硫酸软骨素、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷、硫酸鱼精蛋白、刀豆蛋白a、半胱氨酸、各种离子等其他物质后，所得溶液体系与单独nap-co-t1溶液的荧光发射强度相比没有明显变化。因此，nap-co-t1可以作为荧光传感器用于肝素的检测或用于制备肝素的检测产品，具有荧光专一的选择性、快速响应、信号强、干扰小、结果准确、稳定性好的优点。
32、本发明还提供一种用于检测肝素和鱼精蛋白的试剂、试纸或者试剂盒，其中含有荧光传感器nap-co-t1。
33、本发明还提供一种肝素的可视化的荧光检测方法，包括以下步骤：将荧光传感器nap-co-t1与待测样品充分接触，在可见光照射下，如果观察到明亮的黄色荧光发射，则表明待测样品中含有肝素。
34、本发明还提供一种肝素的荧光检测方法，包括以下步骤：以400～450nm为激发波长，检测含荧光传感器分子nap-co-t1的待测样品混合物在500～600nm处的荧光发射强度。
35、本发明还提供了一种检测鱼精蛋白的试剂，为荧光传感器分子nap-co-t1和肝素形成的复合物。复合物的制备方法为将肝素和荧光传感器分子nap-co-t1混合。肝素与荧光传感器分子nap-co-t1的用量比为1-10g:1mmol，优选为1-5g:1mmol,在本发明的一个优选方案中，为3g:1mmol。
36、本发明还提供一种鱼精蛋白的可视化的荧光检测方法，包括以下步骤：将荧光传感器nap-co-t1与肝素形成的复合物并与待测样品充分接触，在可见光照射下，如果对比观察到明亮的黄色荧光猝灭，则表明待测样品中含有鱼精蛋白。
37、本发明还提供一种鱼精蛋白的荧光检测方法，包括以下步骤：以400～450nm为激发波长，检测含荧光传感器nap-co-t1与肝素结合形成的复合物与待测样品混合物在500～600nm处的荧光发射强度。
38、优选的，荧光传感器nap-co-t1的工作浓度为0.2×10-6mol/l～5×10-6mol/l。
39、优选的，通过肝素浓度与荧光发射强度的线性相关进行定量检测；更优选的，所述定量检测以405nm为激发波长，检测565nm处的荧光发射强度。
40、优选的，荧光传感器nap-co-t1与肝素结合形成的复合物的工作浓度为0.2×10-6mol/l～5×10-6mol/l。
41、优选的，通过鱼精蛋白浓度与荧光发射强度的线性相关进行定量检测；更优选的，所述定量检测以405nm为激发波长，检测565nm处的荧光发射强度。
42、根据荧光传感器nap-co-t1识别肝素的线性相关实验，在405nm激发条件下，肝素溶液浓度与565nm处荧光发射强度呈线性相关，线性范围为0-16.5μg/ml，线性方程为y＝6277.6589+6362.0718x，拟合相似度为0.99379，经计算(3σ/k)检出限为0.04μg/ml，这表明荧光传感器nap-co-t1具有线性响应、低检测限、高灵敏度的优点，具有较强的应用价值。
43、根据荧光传感器nap-co-t1与肝素结合形成的复合物识别鱼精蛋白的线性相关实验，在405nm激发条件下，鱼精蛋白溶液浓度与565nm处荧光发射强度呈线性相关，线性范围为0-13.5μg/ml，线性方程为y＝83928.48652-6005.80499x，拟合相似度为0.99139，这表明荧光传感器nap-co-t1与肝素结合形成的复合物具有线性响应、高灵敏度的优点，具有较强的应用价值。
44、采用本发明的荧光传感器分子，通过上述方法可以对肝素和鱼精蛋白进行定性和/或定量检测。
45、本发明的荧光检测方法中，所述待测样品是水体样品或生物样品。所述生物样品包括但不限于人的血清样品、血浆样品、全血样品、尿液样品、组织液样品。
46、在人血清白蛋白溶液与人工尿液中对肝素的检测实验中，进行了三组实验验证其生物可行性。(1)hep的加入显著诱导了ph＝4-9范围内的荧光发射强度，说明nap-co-t1在生理条件下可用于hep的检测。(2)在0.05％ hsa溶液中，nap-co-t1与hep复合物的荧光强度随着hep浓度的增加(0-84μg/ml)逐渐增加，表明该传感器仍能检测到hsa溶液中对hep的响应。同时，在0-84μg/ml范围内，hep浓度与荧光发射强度呈良好的线性关系，线性方程为y＝7338.6359+250.96766x，拟合相似度为0.99372。此外，hsa的存在并不影响拮抗剂prtm对nap-co-t1+hep复合物的作用。在0-120μg/ml范围内，鱼精蛋白浓度与荧光发射强度呈良好的线性关系，线性方程为y＝27555.09466-141.66718x，拟合相似度为0.98435。(3)将2.5％的人工尿液混合在0.05％的hsa溶液中，虽然纯水系统和hsa溶液系统之间的荧光光谱存在差异，但传感器nap-co-t1仍能对hep作出响应，且在hep浓度为0-111μg/ml的范围内表现出良好的线性关系，线性方程为y＝8873.29233+40.20296x，拟合相似度为0.96369。这样传感器可以避免常见生物检测体系中的干扰，该特性还表明荧光传感器nap-co-t1在hep抗凝治疗和癌症患者尿检中均具有巨大的应用潜力。
47、本发明合成了新型的荧光增强型传感器nap-co-t1，对肝素显示优异的专一选择性，对透明质酸钠、硫酸软骨素、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷、硫酸鱼精蛋白、刀豆蛋白a、半胱氨酸、各种离子等其他物质没有明显响应，具有黄色光发射、快速响应(响应时间仅5s)、稳定性好(至少30min内荧光强度稳定)、低检测限(0.04μg/ml)、干扰小、灵敏度高、检测过程简便等优点，在制备肝素、鱼精蛋白的检测产品方面具有较强的实用价值，并且在临床生物检测方面具有较大的应用价值。
1.一种萘酰亚胺类荧光传感器分子，其特征在于，具有式(ⅰ)所示的结构，
2.权利要求1所述的萘酰亚胺类荧光传感器分子的制备方法，其特征在于，由式(ⅱ)所示化合物与式(ⅲ)所示化合物反应而得；
3.权利要求1所述的荧光传感器在检测肝素和/或鱼精蛋白方面的应用，或者在制备检测肝素和/或鱼精蛋白的产品方面的应用。
4.一种用于检测肝素和/或鱼精蛋白的试剂、试纸或者试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的萘酰亚胺类荧光传感器分子。
5.一种肝素的可视化的荧光检测方法，包括以下步骤：
6.一种检测肝素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以400～450nm为激发波长，检测权利要求1所述荧光传感器与待测样品的混合物在550～600nm处的荧光发射强度。
7.一种用于检测鱼精蛋白的试剂，其特征在于，为权利要求1所述荧光传感器分子与肝素的复合物。
8.一种鱼精蛋白的可视化荧光检测方法，包括以下步骤：将权利要求7所述的试剂与待测样品混合，在可见光照射下观察是否有荧光猝灭；如果对比观察到明显的荧光猝灭，则表明待测样品中含有鱼精蛋白。
9.一种鱼精蛋白的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求7所述的试剂与待测样品充分接触，以400～450nm为激发波长，检测550～600nm处的荧光发射强度。
