一种萘酰亚胺类荧光传感器分子及其制备方法和应用、检测肝素或鱼精蛋白的方法

    专利查询2025-06-26  19


    本发明涉及荧光检测领域,具体涉及一种萘酰亚胺类荧光传感器分子,其制备方法和在检测肝素方面的应用,同时该荧光传感器分子可在结合肝素后用于鱼精蛋白的检测。


    背景技术:

    1、肝素(heparin,hep)是糖胺聚糖(gag)的主要成分之一,由1-4个连接的吡喃糖基葡糖醛酸和2-氨基-2-脱氧葡萄糖残基组成。作为一种带负电荷、线性、高度硫酸化的复合多糖,肝素能与阳离子蛋白结合,并参与细胞生长、粘附、细胞增殖、炎症和凝血等许多生理过程。在医学治疗中,hep通常被用作抗凝药物,通过高结合亲和力灭活抗凝血酶等凝血因子,但过量服用hep可导致出血或血小板减少等并发症。在疾病的鉴别诊断中,gags可覆盖尿路的移行上皮细胞,使细胞免受病原体和致癌物质的粘附。尽管hep存在于细胞外基质或细胞表面,但尿液中排出的hep主要由gag分解产生,其含量与膀胱肿瘤、感染和其他疾病的发生有关。鉴于上述临床应用,无论是在手术或抗凝过程中使用的剂量,还是在肿瘤和感染等疾病的诊断方面,hep的检测都至关重要。

    2、鱼精蛋白(protamine,prtm)是一种带正电荷的强碱性蛋白,在生物医学中,通常可以通过静电吸附与带负电荷的肝素结合,用作肝素过量时的拮抗剂。这使得对于肝素和鱼精蛋白的可逆性检测也十分重要。

    3、在众多检测hep的方法中,活化部分凝血活酶时间(aptt)、活化凝血时间(act)和电化学检测法是较为常见的方法,但这些方法存在许多不足:成本高、需要集中实验室设备的支持,而且仅适用于高剂量的hep。与传统检测技术相比,小分子荧光传感器检测法因其操作简单、反应速度快、选择性好、灵敏度高等优点而备受关注。然而,目前报道的荧光传感器在设计上仍不可避免地存在一些局限性,如检测限低、激发和发射波长短等,因此在传感器的设计策略上仍面临着困难。

    4、综上所述,开发用于肝素检测的具有长发射波长、选择性好、灵敏度高的荧光传感器仍然是一个挑战。


    技术实现思路

    1、本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种新型的萘酰亚胺类荧光传感器分子,可用于肝素(hep)和/或鱼精蛋白的快速准确检测。

    2、本发明还提供了能够延长发射波长、选择性良好、灵敏度高、稳定性好、定性定量检测,并且检测方法简便。

    3、在荧光传感器的结构设计中,本发明采用了将4-溴-1,8-萘酰亚胺荧光团与刚性结构哌嗪结合构成光诱导电子转移(pet)机制的精选结构,再通过与另一种荧光团结合构建高效共振能量转移(fret)机制来规避因激发/发射波长相对较短导致传感器不适宜在生物组织中应用的缺陷,得到新型的荧光传感器。

    4、本发明第一个方案为:一种萘酰亚胺类荧光传感器分子,具有式(ⅰ)所示的结构,

    5、

    6、其中x选自f、cl、br或i。优选的,x选自br或i。

    7、式(ⅰ)所示的荧光传感器的制备方法为,由式(ⅱ)所示化合物与式(ⅲ)所示化合物反应而得到荧光传感器分子。

    8、

    9、其中x选自f、cl、br或i。优选的,x选自br或i。

    10、式(ⅰ)所示荧光传感器的化学名称为1-苄基-4-(1,3-二氧代-6-(4-(2-氧代-2h-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-1h-苯并[de]异喹啉-2(3h)-基)吡啶-1-卤化鎓。在本发明中也命名为“nap-co-t1”。

    11、其中,当x为br时,式(ⅰ)所示荧光传感器的化学名称为1-苄基-4-(1,3-二氧代-6-(4-(2-氧代-2h-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-1h-苯并[de]异喹啉-2(3h)-基)吡啶-1-溴化鎓,在本发明中也命名为“nap-co-t2”;当x为i时,式(ⅰ)所示荧光传感器的化学名称为1-苄基-4-(1,3-二氧代-6-(4-(2-氧代-2h-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-1h-苯并[de]异喹啉-2(3h)-基)吡啶-1-碘化鎓,在本发明中也命名为“nap-co-t1-b”。

    12、式(ⅱ)所示化合物的化学名称为6-(4-(2-氧代-2h-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-2-(吡啶-4-基)-1h-苯并[de]异喹啉-1,3(2h)-二酮,在本发明中也命名为“nap-co”。

    13、式(ⅲ)所示化合物为苄基卤代烃,在本发明中也命名为“hmb”。其中,当x为br时,式(ⅲ)所示化合物的化学名称为溴化苄,在本发明中也命名为“hmb-br”;当x为i时,式(ⅲ)所示化合物的化学名称为苄基碘,在本发明中也命名为“hmb-i”。

    14、上述荧光传感器nap-co-t1的制备方法中:

    15、优选的,式(ⅱ)所示化合物(nap-tpa)与式(ⅲ)所示化合物(hmb)的摩尔比为1∶2~1∶5。

    16、优选的,反应在惰性气体保护下,在乙腈溶剂中进行。

    17、优选的,所述反应在回流条件下进行。

    18、在进一步优选方案中,以4-溴-1,8-萘二甲酸酐为起始原料可制备得到化合物nap-p,包括以下步骤:(a)4-溴-1,8-萘二甲酸酐与4-氨基吡啶反应得到化合物nap-b;(b)化合物nap-b与哌嗪反应得到化合物nap-p。

    19、

    20、化合物nap-b的化学名称为6-溴-2-(4-吡啶基)-1h-苯并[de]异喹啉-1,3(2h)-二酮。

    21、化合物nap-p的化学名称为6-(哌嗪-1-基)-2-(吡啶-4-基)-1h-苯并[de]异喹啉-1,3(2h)-二酮。

    22、上述化合物nap-b的制备方法中:

    23、优选的,步骤(a)4-溴-1,8-萘二甲酸酐与4-氨基吡啶的摩尔比为1∶1~1∶3,回流反应。

    24、优选的,步骤(b)nap-b与哌嗪的摩尔比至少为1∶1,并在乙二醇单甲醚中进行回流反应。

    25、

    26、上述化合物nap-co的制备方法中:

    27、优选的,化合物nap-p和香豆素-3-羧酸比为1∶1~1∶2。

    28、优选的,反应在缩合剂edci、酰化催化剂或活化剂dmap的存在下进行。

    29、优选的,反应温度为0-5℃,反应时间为3-4小时。

    30、本发明制备的荧光传感器nap-co-t1、中间体nap-co均通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱(hr-ms)进行了结构确证,证明具有式(i)、(ii)结构。

    31、研究表明:405nm激发条件下,单独nap-co-t1溶液仅有微弱的荧光发射;当nap-co-t1溶液中加入肝素后,在565nm处的荧光发射强度明显增强,并且荧光响应时间仅5s,响应之后至少30min内都可以保持高强度的荧光发射;而当nap-co-t1溶液中加入透明质酸钠、硫酸软骨素、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷、硫酸鱼精蛋白、刀豆蛋白a、半胱氨酸、各种离子等其他物质后,所得溶液体系与单独nap-co-t1溶液的荧光发射强度相比没有明显变化。因此,nap-co-t1可以作为荧光传感器用于肝素的检测或用于制备肝素的检测产品,具有荧光专一的选择性、快速响应、信号强、干扰小、结果准确、稳定性好的优点。

    32、本发明还提供一种用于检测肝素和鱼精蛋白的试剂、试纸或者试剂盒,其中含有荧光传感器nap-co-t1。

    33、本发明还提供一种肝素的可视化的荧光检测方法,包括以下步骤:将荧光传感器nap-co-t1与待测样品充分接触,在可见光照射下,如果观察到明亮的黄色荧光发射,则表明待测样品中含有肝素。

    34、本发明还提供一种肝素的荧光检测方法,包括以下步骤:以400~450nm为激发波长,检测含荧光传感器分子nap-co-t1的待测样品混合物在500~600nm处的荧光发射强度。

    35、本发明还提供了一种检测鱼精蛋白的试剂,为荧光传感器分子nap-co-t1和肝素形成的复合物。复合物的制备方法为将肝素和荧光传感器分子nap-co-t1混合。肝素与荧光传感器分子nap-co-t1的用量比为1-10g:1mmol,优选为1-5g:1mmol,在本发明的一个优选方案中,为3g:1mmol。

    36、本发明还提供一种鱼精蛋白的可视化的荧光检测方法,包括以下步骤:将荧光传感器nap-co-t1与肝素形成的复合物并与待测样品充分接触,在可见光照射下,如果对比观察到明亮的黄色荧光猝灭,则表明待测样品中含有鱼精蛋白。

    37、本发明还提供一种鱼精蛋白的荧光检测方法,包括以下步骤:以400~450nm为激发波长,检测含荧光传感器nap-co-t1与肝素结合形成的复合物与待测样品混合物在500~600nm处的荧光发射强度。

    38、优选的,荧光传感器nap-co-t1的工作浓度为0.2×10-6mol/l~5×10-6mol/l。

    39、优选的,通过肝素浓度与荧光发射强度的线性相关进行定量检测;更优选的,所述定量检测以405nm为激发波长,检测565nm处的荧光发射强度。

    40、优选的,荧光传感器nap-co-t1与肝素结合形成的复合物的工作浓度为0.2×10-6mol/l~5×10-6mol/l。

    41、优选的,通过鱼精蛋白浓度与荧光发射强度的线性相关进行定量检测;更优选的,所述定量检测以405nm为激发波长,检测565nm处的荧光发射强度。

    42、根据荧光传感器nap-co-t1识别肝素的线性相关实验,在405nm激发条件下,肝素溶液浓度与565nm处荧光发射强度呈线性相关,线性范围为0-16.5μg/ml,线性方程为y=6277.6589+6362.0718x,拟合相似度为0.99379,经计算(3σ/k)检出限为0.04μg/ml,这表明荧光传感器nap-co-t1具有线性响应、低检测限、高灵敏度的优点,具有较强的应用价值。

    43、根据荧光传感器nap-co-t1与肝素结合形成的复合物识别鱼精蛋白的线性相关实验,在405nm激发条件下,鱼精蛋白溶液浓度与565nm处荧光发射强度呈线性相关,线性范围为0-13.5μg/ml,线性方程为y=83928.48652-6005.80499x,拟合相似度为0.99139,这表明荧光传感器nap-co-t1与肝素结合形成的复合物具有线性响应、高灵敏度的优点,具有较强的应用价值。

    44、采用本发明的荧光传感器分子,通过上述方法可以对肝素和鱼精蛋白进行定性和/或定量检测。

    45、本发明的荧光检测方法中,所述待测样品是水体样品或生物样品。所述生物样品包括但不限于人的血清样品、血浆样品、全血样品、尿液样品、组织液样品。

    46、在人血清白蛋白溶液与人工尿液中对肝素的检测实验中,进行了三组实验验证其生物可行性。(1)hep的加入显著诱导了ph=4-9范围内的荧光发射强度,说明nap-co-t1在生理条件下可用于hep的检测。(2)在0.05% hsa溶液中,nap-co-t1与hep复合物的荧光强度随着hep浓度的增加(0-84μg/ml)逐渐增加,表明该传感器仍能检测到hsa溶液中对hep的响应。同时,在0-84μg/ml范围内,hep浓度与荧光发射强度呈良好的线性关系,线性方程为y=7338.6359+250.96766x,拟合相似度为0.99372。此外,hsa的存在并不影响拮抗剂prtm对nap-co-t1+hep复合物的作用。在0-120μg/ml范围内,鱼精蛋白浓度与荧光发射强度呈良好的线性关系,线性方程为y=27555.09466-141.66718x,拟合相似度为0.98435。(3)将2.5%的人工尿液混合在0.05%的hsa溶液中,虽然纯水系统和hsa溶液系统之间的荧光光谱存在差异,但传感器nap-co-t1仍能对hep作出响应,且在hep浓度为0-111μg/ml的范围内表现出良好的线性关系,线性方程为y=8873.29233+40.20296x,拟合相似度为0.96369。这样传感器可以避免常见生物检测体系中的干扰,该特性还表明荧光传感器nap-co-t1在hep抗凝治疗和癌症患者尿检中均具有巨大的应用潜力。

    47、本发明合成了新型的荧光增强型传感器nap-co-t1,对肝素显示优异的专一选择性,对透明质酸钠、硫酸软骨素、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷、硫酸鱼精蛋白、刀豆蛋白a、半胱氨酸、各种离子等其他物质没有明显响应,具有黄色光发射、快速响应(响应时间仅5s)、稳定性好(至少30min内荧光强度稳定)、低检测限(0.04μg/ml)、干扰小、灵敏度高、检测过程简便等优点,在制备肝素、鱼精蛋白的检测产品方面具有较强的实用价值,并且在临床生物检测方面具有较大的应用价值。


    技术特征:

    1.一种萘酰亚胺类荧光传感器分子,其特征在于,具有式(ⅰ)所示的结构,

    2.权利要求1所述的萘酰亚胺类荧光传感器分子的制备方法,其特征在于,由式(ⅱ)所示化合物与式(ⅲ)所示化合物反应而得;

    3.权利要求1所述的荧光传感器在检测肝素和/或鱼精蛋白方面的应用,或者在制备检测肝素和/或鱼精蛋白的产品方面的应用。

    4.一种用于检测肝素和/或鱼精蛋白的试剂、试纸或者试剂盒,其特征在于,含有权利要求1所述的萘酰亚胺类荧光传感器分子。

    5.一种肝素的可视化的荧光检测方法,包括以下步骤:

    6.一种检测肝素的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:以400~450nm为激发波长,检测权利要求1所述荧光传感器与待测样品的混合物在550~600nm处的荧光发射强度。

    7.一种用于检测鱼精蛋白的试剂,其特征在于,为权利要求1所述荧光传感器分子与肝素的复合物。

    8.一种鱼精蛋白的可视化荧光检测方法,包括以下步骤:将权利要求7所述的试剂与待测样品混合,在可见光照射下观察是否有荧光猝灭;如果对比观察到明显的荧光猝灭,则表明待测样品中含有鱼精蛋白。

    9.一种鱼精蛋白的荧光检测方法,其特征在于,包括以下步骤:将权利要求7所述的试剂与待测样品充分接触,以400~450nm为激发波长,检测550~600nm处的荧光发射强度。


    技术总结
    本发明涉及荧光检测传感器领域,提供了一种新型的萘酰亚胺类荧光传感器分子,通过含吡啶基的萘酰亚胺‑香豆素荧光结构骨架与苄卤成盐的反应制备。这种传感器分子可用于肝素和鱼精蛋白的快速准确检测。本发明的荧光传感器分子具有快速响应、专一选择性强、灵敏度高、低检测限、稳定性好、检测过程简便等优点,在制备肝素的检测产品或是鱼精蛋白的检测产品方面具有良好应用前景,在用于人血清白蛋白、血清和尿液中的肝素和鱼精蛋白的检测方面都具有较强的应用价值。

    技术研发人员:曹俭,李雅楠
    受保护的技术使用者:上海工程技术大学
    技术研发日:
    技术公布日:2024/11/26
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