本发明涉及吗啉代核苷单体合成，具体涉及一种基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺。
背景技术：
1、膦酰胺吗啉代寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide，pmo)是一种以吗啉代核苷作为单体并通常以磷酰胺结构相连的人工修饰反义寡核苷链，可高选择性地与dna或rna链以碱基互补配对原则杂交，通过封闭特定mrna序列而实现调节蛋白质的生物合成，在基因功能调控等领域得到了广泛应用。
2、目前pmo的一般合成路线如式(a)所示：
3、
4、主要步骤包括：
5、①吗啉代核苷单体的合成与关键基团保护(化合物1→2)；
6、②膦酰胺结构与吗啉代核苷脱水缩合构建膦酰胺吗啉代核苷(化合物2→3)；
7、③固相合成膦酰胺吗啉代寡核苷酸链及保护基的脱除(化合物3→4)。
8、因此优化提升7’-羟基-n-三苯甲基-吗啉代核苷单体(化合物2)的合成工艺使对于pmo结构反义寡核苷酸类药物研发具有重要应用价值。
9、7’-羟基-n-三苯甲基-吗啉代核苷单体的合成过程中，关键步骤在于五元糖环的扩环反应构建六元环吗啉代核苷。
10、扩环反应涉及氧化、胺化及还原等步骤。申请公布号为us5185444a的美国专利报道了一种在高碘酸钠，氨气及氰基硼氢化钠存在条件下的扩环策略，该策略中核苷五号位需要预先使用tbs基团保护。文献1(zhang,n.；tan,c.；cai,p.；jiang,y.；zhang,p.；zhao,y.tetrahedron letters 2008,49,3570-3573.)则报道了使用常用的dna保护基团即dmtr基团保护的核苷，在高碘酸钠，硼酸铵及氰基硼氢化钠存在的条件下也可以实现核苷分子由五元环到六元环的扩环反应。文献2(pattanayak,s.；paul,s.；nandi,b.；sinha,s.nucleosides nuclectides nucleicacids,2012,31,763-782.)在同样的反应条件下，进一步通过羟基保护基的替换优化，使用叔丁基二苯基硅基(tbdps)作为羟基保护基，也能顺利实现该扩环反应并提高了反应收率。
11、然而，羟基的保护以及脱保护不可避免地导致了更高的生产成本，同时也会对环境造成更大的负担。
技术实现思路
1、针对上述技术问题以及本领域存在的不足之处，本发明提供了一种基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，省去了对五元糖环五号位羟基的保护以及脱保护等步骤，三废小，成本低，后处理方便，易于规模化生产；优化了单体合成的工艺，避免了柱层析纯化方法的使用，操作简单，易于工业放大，为pmo的简便制备提供了吗啉代核苷单体高效合成技术支撑。
2、一种基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，包括：核糖核苷溶解于第一溶剂中，加入氧化剂充分反应后，直接加入胺源，充分反应后过滤得清液，加入氢化还原剂，充分反应后浓缩去除所述第一溶剂，得到油状物，加入良溶剂稀释后滴加不良溶剂析出固体，固液分离后，用不良溶剂打浆，然后固液分离，洗涤固体，干燥，得无取代吗啉代核苷单体；
3、所述核糖核苷具有如下式(i)所示结构：
4、
5、所述无取代吗啉代核苷单体具有如下式(ii)所示结构：
6、
7、式(i)和式(ii)中，b代表碱基，为鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶，具体结构分别如下所示：
8、
9、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，核糖核苷、氧化剂、胺源和氢化还原剂的摩尔比可为1:1.05～1.15:1.25～1.35:1.45～1.55。
10、所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述氧化剂可包括高碘酸钠。
11、所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述胺源可包括(nh4)2b4o7·4h2o。
12、所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述氢化还原剂可包括nacnbh3。
13、所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述第一溶剂可包括水、甲醇、乙醇中的至少一种。
14、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，第一溶剂与核糖核苷的用量比不超过250ml:1mmol。
15、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述氧化剂可以氧化剂水溶液的形式加入。
16、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述氧化剂水溶液中氧化剂的浓度为不小于0.9mmol/ml。
17、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述过滤得清液的具体操作可包括：用硅藻土过滤，用所述第一溶剂洗涤滤饼，收集滤液和洗涤液加入无水硫酸钠干燥，过滤得清液。
18、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，用于洗涤滤饼的所述第一溶剂与核糖核苷的用量比不超过5ml:1mmol。
19、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，加入氢化还原剂时还可加入酸性极性溶剂。
20、所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述酸性极性溶剂可包括乙酸。
21、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述酸性极性溶剂与核糖核苷的摩尔比不超过1.8:1。
22、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，在充分反应后、浓缩去除所述第一溶剂前，可先加碱中和所述酸性极性溶剂。
23、所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述碱可包括三乙胺。
24、所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述良溶剂可包括甲醇、乙醇中的至少一种。
25、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述良溶剂与核糖核苷的用量比不超过5ml:1mmol。
26、所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述不良溶剂可包括乙腈、甲基叔丁基醚(mtbe)中的至少一种。
27、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，用于析出固体所滴加的不良溶剂与核糖核苷的用量比不超过50ml:1mmol。
28、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，打浆所用的不良溶剂与核糖核苷的用量比不超过10ml:1mol。
29、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述洗涤固体所使用的洗涤剂为所述不良溶剂。
30、在一实施例中，所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，所述洗涤剂与核糖核苷的用量比不超过5ml:1mol。
31、所述基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺还可包括：
32、无取代吗啉代核苷单体的吗啉环上n-烷基化反应合成n-取代吗啉代核苷单体；
33、以及可选择性进行的n-取代吗啉代核苷单体的碱基上n’-酰基化反应合成吗啉代n’-取代核苷单体衍生物。
34、本发明的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺是糖环的氧化开环反应、胺化环化反应、氢化还原反应等三步串联反应的简便合成工艺，解决了吗啉代核苷单体现有合成工艺涉及羟基保护、脱保护等额外步骤而导致的三废多、成本高等问题。此外，本发明基于无保护糖环扩环工艺制备出来的吗啉代核苷单体，经吗啉环上n-烷基化反应或碱基上n’-酰基化反应可实现衍生从而制备一系列取代的吗啉代核苷单体。
35、所述无取代吗啉代核苷单体的吗啉环上n-烷基化反应合成n-取代吗啉代核苷单体的路线可表示如下：
36、
37、其中，r1基团可为三苯甲基、c1～c10饱和脂肪烃基、c2～c10不饱和脂肪烃基、c2～c10烷氧基、c6～c10芳基、-ch2-(och2-ch2)nop1、-ch2-(och2-ch2)nnhp1、-ch2-(och2-ch2)nsp1或-ch2-(sch2-ch2)nsp1，其中n为0～10，p1为h、c1～c10饱和脂肪烃基、c2～c10不饱和脂肪烃基、c2～c10烷氧基或c6～c10芳基。
38、所述无取代吗啉代核苷单体的吗啉环上n-烷基化反应合成n-取代吗啉代核苷单体的具体操作可包括：
39、用第二溶剂溶解无取代吗啉代核苷单体，冰水浴冷却条件下，加碱调节ph至8～9，滴加用于引入r1基团的烷基化试剂，滴加完毕后，室温反应完全，用水淬灭，析出固体，固液分离，洗涤固体后用第三溶剂打浆，干燥得n-取代吗啉代核苷单体。
40、所述第二溶剂可包括dmf(n,n-二甲基甲酰胺)。
41、所述碱可包括叔丁醇钾、三乙胺中的至少一种。
42、所述烷基化试剂溶解于所述第二溶剂后再进行滴加。
43、所述第三溶剂可包括甲苯。
44、所述n-取代吗啉代核苷单体的碱基上n’-酰基化反应合成吗啉代n’-取代核苷单体衍生物的路线可表示如下：
45、
46、其中，r2基团可为c1～c10饱和脂肪烃基、c2～c10不饱和脂肪烃基、c2～c10烷氧基或c6～c10芳基。
47、所述n-取代吗啉代核苷单体的碱基上n’-酰基化反应合成吗啉代n’-取代核苷单体衍生物的具体操作可包括：
48、用第四溶剂溶解n-取代吗啉代核苷单体，加入用于引入r2基团的酰氯试剂，碱性环境下充分反应后，用水淬灭，萃取合并有机相，除水、浓缩，反溶剂结晶，所得固体用第五溶剂打浆，固液分离，干燥得吗啉代n’-取代核苷单体衍生物。
49、所述第四溶剂可包括thf(四氢呋喃)。
50、所述碱性环境可由三乙胺、n,n-二异丙基乙胺中的至少一种提供。
51、所述萃取使用的萃取剂可包括ea(乙酸乙酯)。
52、使用无水硫酸钠进行所述除水。
53、所述第五溶剂可包括石油醚、乙腈、正己烷中的至少一种。
54、本发明与现有技术相比，有益效果有：
55、1、本发明采用无保护的核糖核苷糖环扩环策略合成吗啉代核苷单体，与传统方法中硅基保护羟基策略相比，省去了上保护基、脱保护基两步反应，显著提高了合成效率，产率不低于30％，明显高于现有技术一般小于20％的产率。
56、2、本发明所提供的技术方案，操作简单，原料和试剂易得，反应成本低，反应条件温和，底物普适性广，官能团兼容性好。
57、3、本发明避免了柱层析纯化方法的使用，三废小，成本低，后处理方便，操作简单，易于工业放大，为pmo的简便制备提供了吗啉代核苷单体高效合成技术支撑。
1.一种基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，其特征在于，包括：核糖核苷溶解于第一溶剂中，加入氧化剂充分反应后，直接加入胺源，充分反应后过滤得清液，加入氢化还原剂，充分反应后浓缩去除所述第一溶剂，得到油状物，加入良溶剂稀释后滴加不良溶剂析出固体，固液分离后，用不良溶剂打浆，然后固液分离，洗涤固体，干燥，得无取代吗啉代核苷单体；
2.根据权利要求1所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，其特征在于，核糖核苷、氧化剂、胺源和氢化还原剂的摩尔比为1:1.05～1.15:1.25～1.35:1.45～1.55；
3.根据权利要求1所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，其特征在于，所述第一溶剂包括水、甲醇、乙醇中的至少一种；
4.根据权利要求1所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，其特征在于，所述氧化剂以氧化剂水溶液的形式加入；
5.根据权利要求1所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，其特征在于，所述过滤得清液的具体操作包括：用硅藻土过滤，用所述第一溶剂洗涤滤饼，收集滤液和洗涤液加入无水硫酸钠干燥，过滤得清液；
6.根据权利要求1所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，其特征在于，加入氢化还原剂时还加入酸性极性溶剂；
7.根据权利要求1所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，其特征在于，所述良溶剂包括甲醇、乙醇中的至少一种；
8.根据权利要求1所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，其特征在于，所述不良溶剂包括乙腈、甲基叔丁基醚中的至少一种；
9.根据权利要求1或8所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，其特征在于，所述洗涤固体所使用的洗涤剂为所述不良溶剂；
10.根据权利要求1～9任一项所述的基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺，其特征在于，所述基于无保护扩环策略的吗啉代核苷单体全流程合成工艺还包括：
