本发明涉及一种固定化方法，尤其涉及一种共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法。
背景技术：
1、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，gaba）的结构式如式i所示，其相对分子质量为103.12，分子式c4h9no2，呈白色结晶粉末状，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，用于治疗神经系统疾病。γ-氨基丁酸由α-氨基戊二酸脱羧形成，是一种具有四个碳原子的非蛋白氨基酸，广泛分布于植物、动物和微生物中。
2、
3、式i：gaba结构
4、gaba的生产方法很多，目前常用的合成方法有如下几种：①化学合成法制备gaba，由于化学合成gaba反应成本高，副反应多，对环境污染大，限制了其在食品和医药行业中的应用。②植物富集法合成gaba，其虽然能够用于食品和医药行业，但是产率低，周期长。③微生物发酵法制备gaba是以微生物为主体生产gaba，具有环境污染小、成本低、产品收率高、反应条件温和、生产周期短等优点；但是，微生物发酵法在实际的发酵生产中存在易污染、周期长、可重复性差、后期提取繁琐、处理纯化成本高等缺点。④利用酶转化法制备gaba，该方法操作安全温和、易与反应体系分离和规模化生产，目前已被广泛使用，但游离酶存在参与反应后混入产品以及不可回收、重复使用的缺点，也就增加了分离纯化的难度和企业生产成本。
5、将谷氨酸脱羧酶经过固定化后能够保持催化特性不变，由于其具有易分离、可多次重复使用、操作过程可控等特点，近年来得到了研究学者的广泛重视。然而，现有的固定化酶只是将谷氨酸脱羧酶进行了固定，并没有将辅酶plp一起固定，导致辅酶易流失，因此在使用时需要不断补加plp，而外源加入plp不仅增加了下游分离纯化的难度，而且增加了企业plp采购成本。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法，以将谷氨酸脱羧酶及其辅酶共固定催化l-谷氨酸钠合成gaba，从而增加酶的可重复使用性，同时降低生产成本，增加经济效益。
2、本发明首先以fe3o4@pda磁性纳米粒子为载体，通过pda上的邻苯二酚键与谷氨酸脱羧酶（gad）的氨基、巯基共价结合将gad固定到载体表面；然后，接枝聚乙烯亚胺（pei）于fe3o4@pda@gad表面形成pei网络，将gad包裹在里面，得到fe3o4@pda@pei@gad；最后，利用pei表面大量氨基所携带的正电荷对带负电荷的磷酸吡哆醛（plp）进行静电引力吸附，实现gda及其辅酶plp的共固定，得到fe3o4@pda@pei@gad&plp。
3、本发明采用如下技术方案：
4、一种共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法，包括以下步骤：
5、（1）fe3o4@pda共价结合谷氨酸脱羧酶（gad）：向fe3o4@pda磁性纳米粒子中加入谷氨酸脱羧酶酶液，调节反应 ph为7-9，充分搅拌后，经后处理，得到fe3o4@pda@gad纳米粒子；
6、在该反应中，pda表面的邻苯二琨基团与gad酶分子所携带的氨基、巯基发生迈克尔加成反应和席夫碱反应进行固定化酶；
7、（2）fe3o4@pda@gad接枝聚乙烯亚胺并吸附磷酸吡哆醛：向fe3o4@pda@gad纳米粒子中同时加入聚乙烯亚胺溶液和磷酸吡哆醛溶液，调节反应 ph为7-10，振荡孵育后，经后处理，即得到共固定有谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的固定化酶fe3o4@pda@pei@gad&plp；
8、在该反应中，首先以fe3o4@pda@gad纳米粒子为载体接枝pei，在弱碱性条件下，fe3o4@pda@gad纳米粒子表面剩余的邻苯二酚基团被氧化成邻苯二琨，再与pei携带的氨基发生共价结合，将固定有gad的fe3o4@pda纳米粒子包裹在里面，得到fe3o4@pda@gad@pei纳米粒子；然后，以fe3o4@pda@gad@pei纳米粒子为载体，利用pei表面携带的大量正电荷静电引力吸附带负电荷的plp，从而实现gad及其辅酶plp的共固定化，得到fe3o4@pda@pei@gad&plp纳米粒子。
9、进一步的，步骤（1）所述fe3o4@pda磁性纳米粒子与谷氨酸脱羧酶酶液的质量比为20：（1.2-2.4）。
10、进一步的，fe3o4@pda磁性纳米粒子、聚乙烯亚胺溶液和磷酸吡哆醛溶液的质量比20：（10-30）：（0.1-0.5）。
11、进一步的，步骤（1）和步骤（2）所述反应的 ph采用磷酸盐缓冲液进行调节，其中，步骤（1）所述反应的 ph优选为7，步骤（1）所述反应的 ph优选为8.5。
12、进一步的，步骤（1）和步骤（2）所述后处理为将混合物磁分离后，用去离子水洗涤。
13、进一步的，步骤（1）所述fe3o4@pda磁性纳米粒子采用常规方法制备，优选以下方法：
14、向盐酸多巴胺（da）溶液中加入fe3o4纳米粒子，充分搅拌后，依次经洗涤、干燥、研磨，得到fe3o4@pda磁性纳米粒子。
15、更进一步的，fe3o4纳米粒子与盐酸多巴胺溶液的质量比优选1：2。
16、更进一步的，上述fe3o4纳米粒子采用化学共沉淀法制备。
17、具体步骤为：向feso4和fecl3的混合液中滴加氨水，水浴，充分搅拌后磁分离，依次经洗涤、磁分离、干燥、研磨，得到fe3o4磁性纳米粒子；其中，fe2+与fe3+的摩尔比优选为6:5。
18、本发明还提供采用上述方法制备得到的固定化酶fe3o4@pda@pei@gad&plp在制备γ-氨基丁酸中的应用。
19、其中，所述固定化酶fe3o4@pda@pei@gad&plp的最适催化温度为37℃，最适 ph为4.0。
20、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
21、（1）本发明通过在fe3o4@pda@gad载体表面构建pei网络，利用pei表面的氨基携带的正电荷对带负电荷的plp进行静电引力吸附，能够将plp储存于载体表面的pei网络中，实现plp在gad活性位点和pei网络之间交换，阻止辅酶plp的流失。
22、（2）本发明通过将gad与其辅酶plp共固定化，使得在利用gad制备gaba时的后续反应过程无需额外添加辅酶plp，不仅避免了plp流失，节约了成本，而且还能克服外源加入plp导致的后续分离纯化困难的问题，增加gaba在工业生产中的经济可行性。
23、（3）gad与其辅酶plp共固定化之后得到的固定化酶fe3o4@pda@pei@gad&plp的稳定性得到很大提升，经过10次循环使用后，仍然保留了初始固定化酶酶活性的71%。
1.一种共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法，其特征在于，步骤（1）所述fe3o4@pda磁性纳米粒子与谷氨酸脱羧酶酶液的质量比为20：（1.2-2.4）。
3.根据权利要求1所述的共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）所述反应的ph采用磷酸盐缓冲液进行调节。
4.根据权利要求1所述的共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法，其特征在于，fe3o4@pda磁性纳米粒子、聚乙烯亚胺溶液和磷酸吡哆醛溶液的质量比为20：（10-30）：（0.1-0.5）。
5.根据权利要求1所述的共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法，其特征在于，所述后处理为将混合物磁分离后，用去离子水洗涤。
6.根据权利要求1所述的共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法，其特征在于，步骤（1）所述fe3o4@pda磁性纳米粒子的制备方法如下：向盐酸多巴胺溶液中加入fe3o4纳米粒子，充分搅拌后，依次经洗涤、干燥、研磨，得到fe3o4@pda磁性纳米粒子。
7.根据权利要求6所述的共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法，其特征在于，fe3o4纳米粒子与盐酸多巴胺溶液的质量比为1：2。
8.采用权利要求1所述的共固定谷氨酸脱羧酶及其辅酶磷酸吡哆醛的方法制备得到的固定化酶fe3o4@pda@pei@gad&plp在制备γ-氨基丁酸中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固定化酶fe3o4@pda@pei@gad&plp的催化温度为37℃，ph为4.0。
