本发明涉及蛋白质，尤其涉及一种非天然氨基酸、制备方法、氨酰trna合成酶、含有非天然氨基酸的蛋白质或多肽及其应用。
背景技术：
1、组氨酸是酶催化中心使用频率最高的几个氨基酸之一，不仅可以作为亲核基团参与水解酶的过程，同时还可以作为金属配位的位点调控金属中心的功能，通过调控组氨酸的化学结构，可以显著改变酶催化中心的化学多样性，从而有可能改善酶的功能。
2、天然氨基侧链的pka通常在3-12范围内，它们在生理条件下呈现不同的带电状态和配位能力，从而使得不同的蛋白或者同一蛋白的不同区域，呈现不同的理化性质。然而，几乎所有的氨基酸侧链的pka全部落在生理条件的ph范围(ph＝5-9)之外，这也就意味着几乎所有的氨基酸侧链的带电状态和性质在生理ph下，都已经是确定的，例如赖氨酸会带正电，而天冬氨酸会带负电，这一性质不会随着生理ph的波动而变化。唯一pka落在生理ph范围内的天然氨基酸是组氨酸，其侧链的pka为7，也就是当生理条件的ph从6变化到8时，组氨酸侧链会从90％带正电，变为10％带正电，正是这一性质，使得酶的功能和蛋白质的性质可以响应ph在6-8的范围的变化。
3、然而，在天然氨基酸的pka覆盖的范围中，有一段是相对空白的区域：ph＝4.5-7(图1)。天然氨基酸侧链这一化学性质的缺失，意味着天然氨基酸构成的蛋白质功能还存在局限性，限制了蛋白质的功能改造。以水解酶为例，不论是酯酶还是蛋白酶，其催化中心的组氨酸，通常在肿瘤微环境、晚期内体、溶酶体等生理酸性条件下(ph＝5-6)活性都较低，这是因为组氨酸侧链的pka为7，在ph＝5-6范围下，催化中心的组氨酸几乎都被质子化，亲核性较差，进而无法作为亲核中心发挥酶的功能。再比如，以血红素为催化中心的酶，组氨酸作为催化中心铁原子的轴向配体，负责调控铁原子的电性和催化性能，然而无论将轴向配体突变为何种天然氨基酸，其化学结构的改变都是跳跃式的，无法实现对催化中心铁原子的电子性质的微调，从而无法在不改变催化中心反应性质的基础上，调控其催化性能。
4、为了解决上述问题，设计了乙烯基修饰咪唑环的ε位n原子的乙烯基咪唑官能团，成功地将组氨酸的nε-氢的pka从7.07调整到5.71，这一非天然氨基酸侧链的pka填补了天然氨基酸侧链的pka在4.5-7这一范围的“空白”。
5、在许多涉及组氨酸的催化过程中，咪唑的ε位n原子(nε)通常作为参与亲核攻击或金属配位的活性位点，因此，nδ取代的组氨酸可以用来调控nε的催化性能。通过修改咪唑环的取代基，从而有效调整催化中心的性能，从而赋予生物催化剂新的特性。组氨酸类似物的持续开发将成为设计和增强人工酶活性的有力工具。
6、常见的使用组氨酸作为催化中心的酶，包括水解酶和血红素依赖酶。水解酶中组氨酸作为“催化三联体”中的三个氨基酸残基之一，可以参与到酶的功能。而血红素依赖酶中的铁原子与酶骨架中的组氨酸配位，从而调控铁原子的催化性能。
7、利用遗传密码子拓展技术发展新型的可遗传编码的组氨酸类似物可以极大地提高酶的催化功能。遗传密码子拓展技术是一种能够将非天然氨基酸精确引入蛋白质的方法。通过引入正交的氨酰trna合成酶(aars)和trna元件，实现了非天然氨基酸的定点引入。这些元件与内源的aars/trna系统互不干扰，彼此正交。合成酶负责识别非天然氨基酸并将其转移至trna，而trna识别uag密码子并将非天然氨基酸引入肽链。原本作为终止密码子的uag被改造为编码非天然氨基酸的密码子，从而实现基因的正常表达。如果合成酶无法识别非天然氨基酸，基因表达将在uag处终止(图2)。
8、在这种方法中，在宿主细胞(如大肠杆菌)中引入编码aars和trna的基因，将目的蛋白基因中感兴趣的位点突变为tag，并在培养体系中加入相应的非天然氨基酸，即可实现非天然氨基酸在目的蛋白中的定点引入。该流程的关键在于进化出高效识别特定非天然氨基酸的aars。
9、酯酶是水解酶中重要的一类，通常组氨酸是其催化中心。但天然的组氨酸，在生理酸性(ph＝5-6)的条件下，会发生质子化，从而使其丧失亲核能力，造成酯酶在酸性条件下活性很弱。
10、手性环丙烷结构单元是药物分子的关键组成部分，尽管通过有机合成方法可以构建这些结构单元，但通常需要多步转化且产率较低。抹香鲸肌红蛋白卡宾转移酶(myoglobin-h64v，v68a)已被报道能够催化苯乙烯底物的环丙烷化反应。然而，该反应需要在严格的无氧环境下进行，并且对缺电子的苯乙烯底物反应效率较低，限制了其普适性。
11、肌红蛋白卡宾转移酶是一类依赖血红素的金属蛋白酶，通过93位的组氨酸轴向配体调节血红素中心铁的电子性质。通过遗传密码子扩展技术，将天然组氨酸替换为非天然组氨酸轴向配体，将有望调控肌红蛋白卡宾转移酶的催化能力，从而提高其在环丙烷化反应中的效率和适用范围。《自然催化》(nat.catal.2018,1,578-584.)、《acs催化》(acscatal.2019,9,9683-9697.)分别于2018年和2019年报道了利用吡咯赖氨酸氨酰trna合成酶突变体(δmeh-rs)将甲基组氨酸(δmeh)插入到肌红蛋白卡宾转移酶的his-93位，成功获得以δmeh为催化中心的人工金属酶。δmeh的引入破坏了原有的氢键相互作用，降低了组氨酸的给电子能力，从而增强了肌红蛋白卡宾转移酶的活性。然而，上述人工金属酶的构建均需要依赖高浓度的非天然氨基酸δmeh(12mm)，且酶的产量较低。这些限制因素阻碍了该领域的进一步发展。
12、因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
1、鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种非天然氨基酸、制备方法、氨酰trna合成酶、含有非天然氨基酸的蛋白质或多肽及其应用，旨在解决天然组氨酸和甲基组氨酸(δmeh)侧链耐酸性不足，ph＝5-6即发生质子化，酶功能在酸性条件下较低的问题，同时解决甲基组氨酸在蛋白质中的定点插入需要依赖高浓度的非天然氨基酸且插入效率较低的问题。
2、本发明的技术方案如下：
3、本发明的第一方面，提供一种非天然氨基酸，其中，所述非天然氨基酸为组氨酸类似物，所述组氨酸类似物的结构式为如下所示中的一种：
4、
5、其中，x为氨基保护基；y为羧基保护基；a为卤素。
6、可选地，x包括苄氧羰基、苄基、9-芴基甲氧基羰基、叔丁氧羰基和三苯甲基中的一种；
7、y包括甲基、乙基、丙基、异丙基、苄基、叔丁基和三苯甲基中的一种；
8、a包括cl、br和i中的一种。
9、本发明的第二方面，提供一种本发明所述的非天然氨基酸的制备方法，其中，所述非天然氨基酸为组氨酸类似物，所述组氨酸类似物的制备方法包括：
10、步骤a、提供组氨酸，所述组氨酸的结构式为其中ε和δ均表示组氨酸中的氮原子编号；
11、或者，提供氨基被保护的组氨酸、羧基被保护的组氨酸或氨基和羧基同时被保护的组氨酸；
12、步骤b、使用保护基保护所述组氨酸的咪唑环的ε位氮原子；
13、步骤c、通过亲核取代反应对经保护的组氨酸咪唑环的δ位氮原子进行卤乙基化，然后进行卤代烃的消除和脱保护反应，得到所述组氨酸类似物。
14、可选地，所述步骤a中，所述组氨酸的氨基的保护基为苄氧羰基、苄基、9-芴基甲氧基羰基、叔丁氧羰基和三苯甲基中的一种；
15、所述组氨酸的羧基的保护基为甲基、乙基、丙基、异丙基、苄基、叔丁基和三苯甲基中的一种；
16、所述步骤c中，卤原子为cl、br和i中的一种；
17、通过亲核取代反应对经保护的组氨酸咪唑环的δ位氮原子进行卤乙基化时，所采用的原料为卤乙醇的三氟甲磺酸酯。
18、可选地，所述步骤b中，所述组氨酸的ε位氮原子的保护基为苄氧羰基、苄基、9-芴基甲氧基羰基、叔丁氧羰基和三苯甲基中的一种，
19、优选地，所述组氨酸的ε位氮原子的保护基为叔丁氧羰基和三苯甲基中的一种，
20、更优选地，所述组氨酸的ε位氮原子的保护基为三苯甲基。
21、本发明的第三方面，提供一种能够识别本发明所述的非天然氨基酸的氨酰trna合成酶，所述氨酰trna合成酶为δvinh-rs#1、δvinh-rs#2或δvinh-rs#3，所述δvinh-rs#1的序列如seq id no:1所示，所述δvinh-rs#2的序列如seq id no:2所示，所述δvinh-rs#3的序列如seq id no:3所示。
22、本发明的第四方面，提供一种含有非天然氨基酸的蛋白质或者多肽，其中，所述蛋白质或多肽中包含非天然氨基酸，所述非天然氨基酸在蛋白质或多肽中的的结构式为如下所示中的一种或多种：
23、
24、其中，表示非天然氨基酸在蛋白质或多肽中连接的位点。
25、可选的，所述蛋白质为水解酶，所述多肽为具备水解功能的多肽。
26、可选的，所述蛋白质为酯酶，所述多肽为具备水解酯的多肽。
27、可选的，所述蛋白质为具有组氨酸作为金属螯合位点的金属酶。
28、可选地，所述蛋白质为依赖血红素的金属蛋白酶。
29、本发明的第五方面，提供一种本发明所述的含有非天然氨基酸的蛋白质作为生物催化剂在生物催化中的应用。
30、可选的，所述含有非天然氨基酸的蛋白质作为生物催化剂在催化水解反应中的应用。
31、可选的，所述含有非天然氨基酸的蛋白质作为生物催化剂在催化酯类水解反应中的应用。
32、可选地，所述含有非天然氨基酸的蛋白质作为生物催化剂在催化卡宾转移反应中的应用。
33、可选地，所述含有非天然氨基酸的蛋白质作为生物催化剂在催化氮宾转移反应中的应用。
34、可选地，所述含有非天然氨基酸的蛋白质作为生物催化剂在催化自由基转移反应中的应用。
35、可选地，所述含有非天然氨基酸的蛋白质作为生物催化剂在催化苯乙烯底物的环丙烷化反应中的应用。
36、有益效果：本发明的创新关键在于设计并合成了一种全新的组氨酸类似物，尤其是乙烯基组氨酸(δvinh)，并通过蛋白质的定向进化技术成功获得了能够高效识别乙烯基组氨酸的氨酰trna合成酶，该氨酰trna合成酶可以在低浓度的δvinh(0.1mm)下，将δvinh引入蛋白质中，相比于甲基组氨酸的在该浓度下的插入效率，有大幅提升。此外，通过该氨酰trna合成酶将δvinh引入蛋白质，可以显著提高蛋白质的性能，包括酯酶和血红素依赖酶等。
1.一种非天然氨基酸，其特征在于，所述非天然氨基酸为组氨酸类似物，所述组氨酸类似物的结构式为如下所示中的一种：
2.根据权利要求1所述的非天然氨基酸，其特征在于，x包括苄氧羰基、苄基、9-芴基甲氧基羰基、叔丁氧羰基和三苯甲基中的一种；
3.一种权利要求1所述的非天然氨基酸的制备方法，其特征在于，所述非天然氨基酸为组氨酸类似物，所述组氨酸类似物的制备方法包括：
4.根据权利要求3所述的非天然氨基酸的制备方法，其特征在于，所述步骤a中，所述组氨酸的氨基的保护基为苄氧羰基、苄基、9-芴基甲氧基羰基、叔丁氧羰基和三苯甲基中的一种；
5.根据权利要求3所述的非天然氨基酸的制备方法，其特征在于，所述步骤b中，所述组氨酸的ε位氮原子的保护基为苄氧羰基、苄基、9-芴基甲氧基羰基、叔丁氧羰基和三苯甲基中的一种，
6.一种能够识别权利要求1所述的非天然氨基酸的氨酰trna合成酶，所述氨酰trna合成酶为δvinh-rs#1、δvinh-rs#2或δvinh-rs#3，所述δvinh-rs#1的序列如seq id no:1所示，所述δvinh-rs#2的序列如seq id no:2所示，所述δvinh-rs#3的序列如seq id no:3所示。
7.一种含有非天然氨基酸的蛋白质或多肽，其特征在于，所述蛋白质或多肽中包含非天然氨基酸，所述非天然氨基酸在蛋白质或多肽中的结构式为如下所示中的一种或多种：
8.根据权利要求7所述的含有非天然氨基酸的蛋白质或多肽，其特征在于，所述蛋白质为水解酶或酯酶；
9.一种权利要求7-8任一项所述的含有非天然氨基酸的蛋白质作为生物催化剂在生物催化中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述含有非天然氨基酸的蛋白质作为生物催化剂在催化卡宾转移反应、氮宾转移反应、自由基转移反应或水解反应中的应用。
