本发明涉及基因的功能与应用，具体涉及一种以prkar1a作为肥胖及其并发症治疗靶点的应用。
背景技术：
1、肥胖及其并发症是全球公共卫生面临的重大挑战，预计至2030年，全球肥胖人口将超过10亿，且多年来呈快速增长态势。肥胖常引起一系列并发症，包括ii型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病、高脂血症、高血压、代谢综合征及特定类型癌症等，因而严重影响人类健康。
2、肥胖由能量摄入和消耗不平衡导致的体脂过度积累引发，其致病因素包括遗传和环境两个方面。针对肥胖的治疗手段和策略也呈现多样化。然而，当前的治疗措施存在各自应用的局限性和缺点，使其临床效果受到一定限制。例如，饮食习惯常受到文化和生活方式等社会因素影响而难以有效改变；加强运动难以取得持久的减肥效果；抽脂手术风险大、手术效果个体差异大而不可控等。其中，药物治疗仍然是治疗肥胖及其并发症的重要方式，并且在肥胖的长期治疗中取得了较为显著的临床效果，目前已获批上市的药物包括奥利司他(orlistat)、芬特明(phentermine)、妥品美(topiramate)和青蒿琥酯(artesunate)等。然而，当前药物治疗手段仍面临多方面挑战：(1)针对不同个体的治疗效果差异大，难以做到个性化和普遍高效性；(2)不少药物产生对包括神经系统和心血管系统在内的严重副作用和损伤，使用安全性不够高；(3)有些药物的作用机理尚不十分明确，造成潜在的脱靶毒性；(4)部分药物清除率低，容易造成组织器官的长期药物蓄积而损害健康等。因此，急需开发治疗肥胖的新型药物以改善当前治疗的有效性和安全性。
3、一般而言，肥胖病人除体重异常偏高外，还常伴有机体营养能量代谢紊乱而引起的高血糖、高血脂和器官组织脂质异常积累等。当前肥胖治疗急需综合性抵抗肥胖及其一系列并发症，从而达到良好的长期治疗效果并减少复发。由于机体营养和能量代谢调节信号呈现复杂的网络调控特征，各种代谢途径和通路间高度交叉互作，因此临床治疗肥胖的措施必须尽量减少对机体其他代谢方面的副作用，提高治疗的整体安全性。全身性干预代谢调控因子常导致严重的副作用，安全性无法得到有效保证大大限制了其临床应用。
4、环磷酸腺苷(camp)-蛋白激酶a(pka)信号通路是g蛋白耦联受体(gpcr)介导的细胞内信号转导途径之一，它参与了细胞内多种生理过程的调控。pka全酶蛋白由两个调节亚基(prkar1a和prkar1b)和两个催化亚基(prkaca和prkacb)组成，且每种亚基尚有不同亚型。我们发现特异性敲除肝脏prkar1a的编码基因prkar1a从而激活pka信号可有效降低小鼠体重，与此同时无其他明显的副作用，提示我们特异性干扰肝脏prkar1a而激活pka信号可有效治疗肥胖。
技术实现思路
1、为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的首要目的在于提供一种以prkar1a作为肥胖及其并发症治疗靶点的应用。
2、本发明的另一目的在于提供一种肝脏特异性敲除prkar1a小鼠的构建及相关指标的检测方法。为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
3、本发明以aav8型腺相关病毒载体介导的肝脏特异性敲除prkar1a小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导肥胖及其并发症小鼠模型，结果表明：与对照小鼠相比，特异性敲除小鼠肝脏prkar1a基因显著减轻高脂饮食喂养的小鼠体重、肝重及脂肪组织重量；特异性敲除小鼠肝脏prkar1a显著降低血脂和肝脂水平，减少肝脏脂质积累；此外，特异性敲除肝脏prkar1a的小鼠胰岛素敏感性显著提升，有效改善胰岛素抵抗症状。这提示prkar1a可作为肥胖及其并发症临床治疗的靶点，为新型减肥药物的研发和临床治疗手段的开发提供了新的思路和应用前景。
4、针对prkar1a的上述功能，本发明提供一种以prkar1a作为肥胖及其并发症治疗靶点的应用，所述应用，包括但不限于：以prkar1a作为肥胖治疗靶点的应用，以prkar1a作为糖尿病治疗靶点的应用，以prkar1a作为高血脂治疗靶点的应用，以prkar1a作为高血压治疗靶点的应用，以prkar1a作为动脉粥样硬化治疗靶点的应用，以prkar1a作为心血管疾病治疗靶点的应用，以prkar1a作为脂肪肝相关疾病治疗靶点的应用，以prkar1a作为增强胰岛素敏感性相关疾病治疗靶点的应用。
5、所述应用为非诊断和非治疗目的。
6、本发明提供一种肥胖及其并发症的治疗靶点，所述肥胖及其并发症的治疗靶点为prkar1a。
7、本发明提供一种以prkar1a作为肥胖及其并发症的治疗靶点的检测方法，所述检测方法包括：以aav8型腺相关病毒载体介导的肝脏特异性敲除prkar1a小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导肥胖及其并发症小鼠模型，与对照小鼠相比，进行指标测定，获得检测结果。
8、所述指标测定包括称量体重、胰岛素耐受实验、血清及肝脏样本甘油三酯(tg)和总胆固醇(tc)含量测定和肝脏脂质堆积情况测定中的至少一种。
9、所述应用包括prkar1a基因或其编码蛋白的缺失、表达抑制或失活后的应用以及prkar1a基因或其编码蛋白作为靶点的应用。
10、本发明中的prkar1a基因详情见美国国家生物技术信息中心数据库(ncbigenbank，https://www.ncbi.nlm.nih.gov)(人类基因id:5573；小鼠基因id:19084)。prkar1a基因或其编码蛋白的缺失、表达抑制或失活均可采用分子细胞生物学常规手段实现，如病毒载体介导的基因编辑、基因沉默、显性失活突变体的表达、pka活性激动剂等。
11、本发明前述的应用，为非诊断和非治疗目的。
12、另一方面，本发明提供一种肝脏特异性敲除prkar1a小鼠的构建及相关指标的检测方法，具体包括：
13、(1)针对prkar1a序列设计特异性sgrna，克隆至包含肝脏特异性启动子tbg启动重组酶cre表达序列的aav8型病毒载体质粒中，获得aav8-tbg.cre.u6.sgprkar1a质粒；
14、(2)将上述质粒转染至体外培养的hek293t细胞中表达并自组装产生aav8-tbg.cre.u6.sgprkar1a病毒颗粒，收集病毒液并纯化；
15、(3)病毒液尾静脉注射感染条件性cas9敲入小鼠(rosa26-cag-lsl-cas9)，使其在肝脏中特异性表达cre，从而启动cas9在肝细胞中特异性表达，与此同时表达prkar1asgrna，进而实现肝细胞特异性沉默prkar1a(prkar1a lko小鼠)；
16、(4)病毒注射后1周以上，采集血清及其他组织样本用于检测分析。
17、进一步地，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no：1和seq id no：2所示。
18、seq id no：1和seq id no：2分别为5’-tgc tgc ctc cta cgt tag aa-3’，和5’-acc ttg atg ata acg aga ga-3’。
19、进一步地，所述aav8-tbg.cre.u6.sgprkar1a质粒的核苷酸序列如seq id no：3所示。
20、进一步地，所述aav8-tbg.cre.u6.sgprkar1a质粒图谱如图10所示。
21、进一步地，所述lsl cas9全名为rosa26-cag-lsl-cas9，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
22、进一步地，所述prkar1a lko：aav8-tbg.cre.u6.sgprkar1a质粒包装成aav8病毒，尾静脉注射至rosa26-cag-lsl-cas9小鼠即获得prkar1a lko小鼠。
23、本发明提供一种新的通过特异性干扰肝脏prkar1a来调节机体能量代谢从而治疗肥胖及其并发症的应用，获得了显著的治疗效果，并没有发现明显的副作用。
24、本发明在小鼠个体水平验证了prkar1a的肝特异性缺失减少了机体脂质积累，增强了胰岛素敏感性并抵抗高脂饮食诱导的肥胖。本发明证实，只需肝脏特异性缺失一种代谢调控因子pka的一个调节亚基prkar1a，即可达到显著抵抗高脂饮食诱发的体重增加、脂质积累和胰岛素敏感性降低等症状，并且没有观察到明显的毒副作用，有望应用于临床上有体重控制和改善机体营养能量代谢需求的人群，达到提高人类健康水平的目的。
25、本发明的有益效果：
26、(一)本发明提供肥胖药物治疗的潜在新靶点
27、与对照小鼠相比，特异性敲除小鼠肝脏prkar1a基因显著降低高脂饮食喂养的小鼠体重(图3a和b)和肝重(图4)；同时，腹股沟白色脂肪组织(iwat)和棕色脂肪组织(bat)重量也有显著降低，附睾白色脂肪组织(ewat)重量有降低趋势(图5)。此结果表明，特异性敲除肝脏prkar1a即可有效抵抗高脂饮食诱导的肥胖发生。
28、(二)对于肥胖并发的高血脂症状、脂肪肝有明显的缓解效果
29、与对照小鼠相比，特异性敲除小鼠肝脏prkar1a显著降低血清甘油三酯(tg)和总胆固醇(tc)水平(图6)，对于肥胖并发的高血脂症状有明显的缓解效果。与此同时，肝切片的油红o染色结果显示，特异性敲除小鼠肝脏prkar1a显著减少了高脂饮食引起的肝脏脂质积累(图7)；相应地，肝脏甘油三酯水平有较为显著的降低(图8)。结果表明，特异性敲除肝脏prkar1a可有效抵抗肥胖并发的脂肪肝。
30、(三)有效改善肥胖并发的胰岛素抵抗和糖代谢异常症状
31、在高脂饮食喂养条件下，特异性敲除肝脏prkar1a的小鼠胰岛素敏感性相比对照组小鼠显著提升(图9)，因而有效改善肥胖并发的胰岛素抵抗和糖代谢异常症状。
1.一种肥胖及其并发症的治疗靶点，其特征在于，所述肥胖及其并发症的治疗靶点为prkar1a(人类基因id:5573；小鼠基因id:19084)。
2.一种以prkar1a作为肥胖及其并发症的治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：以aav8型腺相关病毒载体介导的肝脏特异性敲除prkar1a小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导肥胖及其并发症小鼠模型，与对照小鼠相比，进行指标测定，获得检测结果。
3.根据权利要求2中所述的以prkar1a作为肥胖及其并发症的治疗靶点的检测方法，其特征在于，具体包括：
4.根据权利要求3中所述的以prkar1a作为肥胖及其并发症的治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，sgrna的核苷酸序列如下：5’-tgc tgc ctc cta cgt tag aa-3’，和5’-acc ttg atg ata acg aga ga-3’。
5.根据权利要求3中所述的以prkar1a作为肥胖及其并发症的治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述aav8-tbg.cre.u6.sgprkar1a质粒的核苷酸序列如seq idno：3所示。
6.根据权利要求2中所述的以prkar1a作为肥胖及其并发症的治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述指标测定包括称量体重、胰岛素耐受实验、血清及肝脏样本甘油三酯(tg)和总胆固醇(tc)含量测定和肝脏脂质堆积情况测定中的至少一种。
7.根据权利要求3中所述的以prkar1a作为肥胖及其并发症的治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述lsl cas9全名为rosa26-cag-lsl-cas9，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
8.根据权利要求3中所述的以prkar1a作为肥胖及其并发症的治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述prkar1a lko：aav8-tbg.cre.u6.sgprkar1a质粒包装成aav8病毒，尾静脉注射至rosa26-cag-lsl-cas9小鼠即获得prkar1a lko小鼠。
9.一种以prkar1a作为肥胖及其并发症的治疗靶点在制备肥胖及其并发症治疗药物上的应用，所述应用为非诊断和非治疗目的。
10.根据权利要求5中所述的应用，其特征在于，所述肥胖及其并发症包括以下至少一种：以prkar1a作为肥胖治疗靶点的应用，以prkar1a作为糖尿病治疗靶点的应用，以prkar1a作为高血脂治疗靶点的应用，以prkar1a作为高血压治疗靶点的应用，以prkar1a作为动脉粥样硬化治疗靶点的应用，以prkar1a作为心血管疾病治疗靶点的应用，以prkar1a作为脂肪肝相关疾病治疗靶点的应用，以prkar1a作为增强胰岛素敏感性相关疾病治疗靶点的应用。
