本发明属于动物模型构建，具体涉及一种mbl点突变动物模型的构建方法。
背景技术：
1、甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin,mbl)突变小鼠在研究宿主防御方面具有重要作用。目前构建的mbl突变小鼠均为基因完全敲除小鼠，如mbl-a和mbl-c小鼠(mbl-null)的肝脏(mbl合成的主要场所)中，没有内源基因表达，血清也无法检出mbl蛋白。该种小鼠存活率高、繁殖力强、体型正常，没有明显的发育缺陷，对6-10周龄小鼠多个器官的组织学检查也未发现异常。检测补体活性发现，虽然mbl-null小鼠的补体经典途径不受影响，但补体凝集素依赖性途径却不起作用。
2、目前，mbl缺陷小鼠多用于研究宿主防御，包括炎症和感染、细胞凋亡和缺血再灌注模型的补体途径异常活化等：如在静脉注射金黄色葡萄球菌后，mbl缺失小鼠的死亡率增加，同时血清中tnf-α和il-6水平异常(注射后2小时下降，24小时后升高)；mbl-null小鼠在化疗药物环磷酰胺诱导的发热性中性粒细胞减少后，进行金黄色葡萄球菌接种，其肾脏、肝脏和肺形成脓肿的易感性大幅度增加。即使，血循环的中性粒细胞恢复到正常水平，这些小鼠仍会出现持续性菌血症；此外，mbl缺陷小鼠在烧伤后，感染铜绿假单胞菌的易感性增加；在注射单纯疱疹病毒-2后，其肝脏对病毒的清除功能存在缺陷；有研究发现突变小鼠在双侧肾脏缺血再灌注和心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，i/r)后能免受脏器损伤，伴c3升高。
3、iga肾病作为全球最常见的原发性肾小球肾炎之一，也是一种自身免疫性疾病。该病基因背景复杂，临床预后异质性大，且无特异性治疗方案。“四重打击”的发病机制假说，聚焦于iga肾病损伤发生的关键环节——补体活化，以凝集素途径与旁路途径为主。在参与肾脏进展方面，前者更为重要。
4、作为激活补体凝集素途径的主要始动分子，mbl能够识别多种病原微生物，在防御抵抗多种病原微生物的天然免疫中起着重要作用。有研究发现，功能性mbl缺乏可能是人类中最常见的免疫缺陷，占人群的已经发现许多疾病如反复感染、原发和继发免疫缺陷、心血管疾病和习惯性流产等都与mbl缺乏相关，尤其是自身免疫性疾病与mbl基因缺陷所致mbl水平异常等关系密切。因此，研究mbl的遗传变异在iga肾病进展中的作用，有助于及早针对性干预，及为补体生物制剂的靶向治疗来奠定理论基础。
5、然而目前已有的小鼠模型多为mbl完全性基因敲除，该获得全身所有组织和细胞都不表达该基因的小鼠模型多用于研究mbl的编码基因对全身的生理病理功能。对于特定的自身免疫性疾病(例如iga肾病)，mbl完全性基因敲除小鼠作为动物模型进行后续疾病造模并不适用。而crispr/cas9系统能够对小鼠和大鼠的基因组特定基因位点进行精确编辑。基于申请者前期在大型队列研究中发现，mbl2基因的g54d点突变导致iga肾病患者进展风险增加37.1倍，但作用机制未明。此外，既往报道从未涉及mbl2相关点突变小鼠的免疫动物模型。
技术实现思路
1、本发明基于上述研究进行，应用crispr/cas9技术，对小鼠基因组特定基因突变位点(对应人mbl2的g54d突变)进行敲除，首次建立mbl2基因的g54d点突变小鼠。
2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明提供的mbl点突变动物模型的构建方法概述如下：合成grna和donor oligo后，混合制备得到rnp复合物；而后将该rnp复合物与质粒dna进行稀释混合形成注射液，注射入受精卵内并进行胚胎移植；鉴定初生的f0代动物，并进行转基因动物的传代和建系。
4、优选的，本发明提供的mbl点突变动物模型的构建方法的具体步骤如下：
5、1、合成grna和donor oligo
6、grna的核苷酸序列如下：gatgggagagatggacccaaagg(seq id no.1)；
7、donor oligo的核苷酸序列如下：
8、acctgtgaggacaccctgaagacttgctctgtgatagcctgtggcagagatgggagagatgatcccaaaggggagaagggagaaccaggtatagagtactgtactctggctttacatccagtg(seq id no.2)。
9、2、制备rnp复合物
10、(a)管1溶液：在体积为m的rnase-free水中加入体积为15～16％m的100pmol/μl的crrna，再加入体积为15～16％m的100pmol/μl的tracrna混匀孵育，之后再加入3～4％m的cas9蛋白混匀孵育得到管1溶液；
11、其中，crrna(crispr rna)序列购买自idt公司，tracrrna(trans-activatingcrrna)序列购买自金斯瑞生物科技股份有限公司。crrna将会与tracrrna结合形成sgrna。
12、(b)管2溶液：终浓度为15ng/μl的donor质粒；
13、(c)将管1溶液和管2溶液混合得到rnp复合物。
14、3、受精卵注射
15、将rnp复合物与质粒dna进行稀释混合形成注射液，该注射液中cas9蛋白浓度为30ng/μl；crrna和tracrna的浓度均为2pmol/μl；质粒dna的浓度为15ng/μl。
16、注射液通过显微注射方式注射到受精卵细胞核内，注射完毕的受精卵转移到m16培养基中，并放入37℃恒温5％的co2培养箱内，培养一定时间后进行移植。
17、4、初生f0代动物鉴定及传代和建系
18、4.1鉴定
19、初生的f0代动物中经鉴定有整合情况的称为首建动物，鉴定方法采用点突变pcr检测以及高通量测序pcr，两种pcr检测用引物序列相同，如下表1所示：
20、表1点突变pcr检测以及高通量测序pcr引物序列
21、 引物序列 编号 f：5'-aagctataagccaagtgagatggaatttg-3' seq id no.3 r：5'-caagcctctccaggtcatgggtt-3' seq id no.4
22、进行高通量测序时，采用上述正向引物序列作为引物。
23、4.2传代和建系：
24、(a)将带有外源基因的动物与未经转基因的动物交配、传代；每只首建动物都需要独立进行传代；
25、(b)对出生的f1代动物进行鉴定，可将获得的f1阳性动物用于实验和继续传代；
26、(c)如果需要获得纯合子，可能来源相同的的阳性f1进行同胞交配，出生的f2代动物中，会有25％的概率为纯合子；
27、(d)将筛选出目的基因有表达的小鼠，建系稳定的传代，同时记录传代情况和谱系。
28、本发明中可采用的实验动物为非人哺乳动物；进一步优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物；最优选的，所述啮齿类动物为小鼠。其为选自balb/c、a、a/he、a/j、a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、dba/2、km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠。
29、本发明第二方面，提供了一种mbl点突变动物模型，采用上述所述的构建方法构建得到。
30、该动物模型可用于特定的自身免疫性疾病(例如iga肾病)的机理研究、药靶筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、毒理研究等。
31、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
32、本发明首次建立了mbl2基因的g54d点突变的模式动物，该模型体内不能正常表达g54d蛋白，可用于g54d蛋白的功能研究，如g54d点突变导致iga肾病的机理等。该动物模型的建立和应用，将有助于深入理解g54d点突变在自身免疫性疾病中的作用及其作为潜在治疗靶点的重要性。
33、利用本发明制备的动物模型可用于针对g54d靶位点的药物筛选、药效研究，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究g54d蛋白的功能和药物筛选提供了有力工具。
1.一种mbl点突变动物模型的构建方法，其特征在于，合成grna和donor oligo后，混合制备得到rnp复合物；而后将该rnp复合物与质粒dna进行稀释混合形成注射液，注射入受精卵内并进行胚胎移植；鉴定初生的f0代动物，并进行转基因动物的传代和建系。
2.根据权利要求1所述的mbl点突变动物模型的构建方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的mbl点突变动物模型的构建方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的mbl点突变动物模型的构建方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的mbl点突变动物模型的构建方法，其特征在于：
6.根据权利要求1所述的mbl点突变动物模型的构建方法，其特征在于：
7.根据权利要求1所述的mbl点突变动物模型的构建方法，其特征在于：
8.根据权利要求1所述的mbl点突变动物模型的构建方法，其特征在于：
9.根据权利要求8所述的mbl点突变动物模型的构建方法，其特征在于：
10.一种mbl点突变动物模型，其特征在于，采用权利要求1～5任一项所述的构建方法构建得到。
