本发明属于分子生物学及基因工程，涉及一种香紫苏子叶和下胚轴离体再生及遗传转化体系的建立方法。
背景技术：
1、香紫苏，学名: salvia sclareal，别名莲座鼠尾草、南欧丹参，是唇形科鼠尾草属,野生种为多年生双子叶草本植物，著名香料植物。香紫苏产业涉及的主要产品包括香紫苏精油、香紫苏内酯和降龙涎香醚，具有较高的附加值。目前国内对香紫苏的研究主要是对其次生代谢产物提取的研究，国外则侧重香紫苏医学及农用方面的研究，比如抗肿瘤活性及用于治疗癌症、白血病和抑制真菌生长等。然而对香紫苏基因工程方面的研究较少。
2、香紫苏作为一种经济作物，既是一种芳香植物也是一种药用植物。因此被得到广泛的应用。虽然传统的植物育种在提高香紫苏品质方面发挥了一定的作用，但常规育种持续的时间较长而且这些产品的产量仍然很低。草害也是长期以来困扰香紫苏生产的难题，草害严重的香紫苏田可减产30%-50%。香紫苏对药剂比较敏感，目前生产主要以人工拔除为主，人工除草效率低，劳动成本高，杂草防除是制约其规模化种植的瓶颈。
3、通过遗传转化技术,将理想的基因转移到受体植物基因组中去，达到定向改良的目的，为香紫苏的育种提供了新途径。目前，随着相关技术的进步，通过遗传转化方法培育具有优良性状的新品种已经成为现实。随着转基因研究的不断深入，所能改变的性状并不只局限于抗逆、抗虫或者抗病，而且延伸到对环境胁迫的抗性等方面中。然而，香紫苏种子见水表面光滑，难以消毒，萌发率较差。无菌操作技术要求高，转化周期较长，外植体褐化率较高，再生苗难生根等问题。需优化的体系较多，工作繁重。这严重影响了香紫苏再生体系的成功构建，导致至今针对香紫苏再生及遗传转化体系的研究还尚未见报道。基于此，目前还没有一套合适的遗传转化体系能用于将抗性基因等转入香紫苏从而达到推进香紫苏定向遗传改良。
技术实现思路
1、香紫苏作为我国的一种经济作物，由于其离体再生及遗传转化缺失的现状，使其在遗传育种改良方面的应用受到一定限制。本发明的主要目的是提供了一种香紫苏子叶和下胚轴离体再生及遗传转化体系的建立方法，该方法成功的获得了遗传转化的香紫苏苗。
2、本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：
3、一种香紫苏子叶和下胚轴离体再生的方法，所述方法包括如下步骤:
4、对香紫苏的种子进行消毒，播种于种子萌发培养基上；
5、以香紫苏的子叶和下胚轴为外植体进行诱导培养，诱导培养包括愈伤组织诱导培养、芽的诱导培养和根的诱导培养。
6、在其中的一个实施例中，香紫苏种子的消毒要用混合灭菌液（70% 酒精和0.1%升汞比例为1:4）。
7、在其中的一个实施例中，香紫苏种子的萌发培养基为以1/2ms为基础培养基，还添加了15g/l蔗糖、9g/l琼脂条和1mg/lga3。
8、在其中的一个实施例中，香紫苏种子进行避光培养，培养时间为12天。
9、在其中的一个实施例中所述的愈伤组织诱导及芽诱导的培养基以ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分: 30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+2.0-3.0mg/l6-ba+0.2-0.4mg/liaa+250-350mg/l vc。
10、在其中的一个实施例中，所述的根诱导的培养基以1/2ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分:15g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.125-1.5mg/l naa+0.1 -0. 5mg/l iaa+0.1-0.5 mg/l iba+250-350mg/l vc+0.5 -1mg/lga3。
11、以香紫苏的子叶和下胚轴为遗传转化受体，用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的菌液侵染所述遗传转化受体；将侵染所述的遗传转化受体接种于共培养培养基，共培养；
12、将共培养所述的遗传转化受体进行诱导培养，诱导培养包括愈伤组织诱导培养、芽的诱导培养和根的诱导培养；将获得的遗传转化苗进行练苗、移栽以及后续阳性植株的pcr鉴定；
13、在其中的一个实施例中，香紫苏的遗传转化受体要进行暗培养，暗培养的培养基为ms培养基+30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+1.0mg/l 6-ba+0.375mg/l iaa，暗培养的条件为21℃-25℃下暗培养两天。
14、在其中的一个实施例中，侵染液为ms培养基+15g/l蔗糖+15g/l葡萄糖+50-100mg/l乙酰丁香酮（as），ph值为5.8；菌液od600为0.4-0.6，菌液中含有50-100mg/l乙酰丁香酮（as），侵染的时间为10min；愈伤组织诱导及芽诱导培养培养基成分为ms培养基+30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+2.0-3.0mg/l 6-ba+0.2-0.4mg/l iaa+250-350mg/l vc+200-250 mg/l 特美汀+10-20mg/l潮霉素；芽诱导的培养条件包括：温度为21-25℃，光照强度为1000lx-1200lx，培养基更换周期为10-15d；根诱导的培养培养基成分为1/2ms培养基+15g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.125-1.5mg/l naa+0.1 -0. 5mg/l iaa+0.1 -0.5 mg/liba+250-350mg/lvc+0.5 -1mg/lga3+200-250 mg/l 特美汀+10-20mg/l潮霉素；所述的方法还包括对鉴定出来的阳性植株进行练苗和移栽的步骤。
15、与现有的技术相比，本发明具有以下优点：
16、本发明提供的香紫苏子叶和下胚轴离体再生的方法，通过对香紫苏种子暗培养及ga3处理获得了幼嫩的子叶及较长的下胚轴，避免了较老的外植体（叶片表面会出现绒毛，影响愈伤组织的形成）对香紫苏再生的影响。本发明根据香紫苏自身的特点，更为了获得大量的转基因植株，通过降低香紫苏种子的污染率，并减轻消毒剂对香紫苏种子的伤害，减轻外植体的褐化率，提高香紫苏的遗传转化率。
17、本发明针对香紫苏，以子叶和下胚轴作为遗传转化受体，在用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的侵染液侵染所述遗传转化受体以及对侵染过的遗传转化受体进行共培养的过程中，通过在侵染液中加入乙酰丁香酮，特别是在芽诱导培养基中加入了维生素c，大大减轻了香紫苏外植体的褐化率，提高了抗性芽的诱导效率。首次实现了农杆菌介导的香紫苏遗传转化。同时，发明人通过重复实验发现，采用本发明的方法，重复性和稳定性好，不受季节环境的影响，可适用于批量化育苗，有利于推进香紫苏的产业化发展。整体来讲，本发明提供的方法，为实现外源基因对香紫苏的改良建立了技术基础并提供了有效平台。
1.一种香紫苏子叶和下胚轴离体再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于香紫苏种子在4℃冰箱春化两天后，在无菌操作台中用混合灭菌液（70%酒精和0.1%升汞比例为1:4）进行消毒，消毒2min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述芽诱导培养基还包含0.25 -0.35mg/l维生素c（vc）。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述根诱导培养基还包括以下含量组分：250-350mg/l vc和0.5 -1mg/lga3。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述芽诱导的培养条件包括：温度为21-25℃，光照强度为800lx-1000lx，培养基更换周期为10-15d。
6.一种香紫苏子叶和下胚轴遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，ms液体培养基为以ms为基础培养基，还添加了15g/l蔗糖、15g/l葡萄糖和50-100mg/l乙酰丁香酮（as），ph值为5.8。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的遗传转化受体经预培养之后再用携带有植物表达载体的根癌农杆菌侵染；预培养的时间为2-3d，预培养的培养基为ms培养基+30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+1.0mg/l 6-ba+0.375mg/l iaa；预培养的条件为21-25℃避光培养。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液还含有50 -100mg/l乙酰丁香酮。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的共培养基成分为ms培养基+30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+1.0mg/l 6-ba+0.375mg/l iaa+250mg/l vc。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的芽诱导培养培养基成分为ms培养基+30g/l蔗糖+9g/l琼脂条+1.5-3.0mg/l 6-ba+0.2-0.4mg/l iaa+250-350mg/l vc+200-250 mg/l 特美汀+10-20mg/l潮霉素；培养基更换频率为10-15d更换一次。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，芽诱导的培养条件光强为800-1000lx；培养温度为21℃-25℃。
13.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的根诱导培养培养基成分为1/2ms培养基+15g/l蔗糖+9g/l琼脂条+0.125-1.5mg/l naa+0.1 -0. 5mg/l iaa+0.1 -0.5 mg/liba+250-350mg/l vc+0.5-1mg/lga3+200-250 mg/l 特美汀+10-20mg/l潮霉素。
14.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体为pcambia1300，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌lba4404。
15.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述菌液od600为0.4-0.6。
16.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对遗传转化所获得植株进行pcr分子检测；对pcr分子检测为阳性的植株进行练苗与移栽。
