本发明涉及dha藻油精炼，具体涉及一种从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法。
背景技术：
1、dha（二十二碳六烯酸）俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，是神经系统细胞生长及维持的重要营养物质。
2、dha的生产来源主要包括海洋鱼油和海洋微藻。其中，以海洋鱼油作为生产来源，具有产量不稳定、提取率低、鱼腥味重的缺点，且海洋鱼油中含有难以去除的胆固醇、脂溶性维生素、ω-6脂肪酸，过量摄入对人体有很大的副作用，此外，海洋鱼油中还含有epa（二十碳五烯酸），因此精炼工艺复杂，成本高；以海洋微藻作为生产来源，具有产量稳定、提取率高、无鱼腥味重的优点，且海洋微藻中的脂肪酸组成简单，dha占总脂肪酸的30-50%，其他长链多不饱和脂肪酸的含量不超过1%，不含有epa，易于dha的精炼，是最理想的dha来源。
3、以海洋微藻作为生产来源时，主要的生产方法为对海洋微藻发酵液进行提取后，得到含有大量磷脂、蛋白质、胶状物质、色素、游离脂肪酸等杂质的粗油，然后进行精炼，具体为进行脱胶、脱酸、脱色、脱臭，得到dha。目前，常用的提取方法为对海洋微藻发酵液进行酶法破壁后，使用酒精进行提取，通过离心去除残渣；常用的脱胶方法为酸化脱胶，具体为通过加入磷酸、柠檬酸等酸性物质去除粗油中的胶装物质；常用的脱酸方法为向脱胶后的粗油中加入碱和游离脂肪酸进行皂化，然后去除皂化物，从而降低脱胶后的粗油的酸价；常用的脱色方法为向脱酸后的粗油中加入活性炭进行物理吸附，将色素进行吸附后，通过离心或者过滤去除吸附后的物理吸附剂；常用的脱臭方法为向脱酸后的粗油中通入蒸汽，利用dha与臭味物质的挥发度差异去除臭味。
4、但是上述方法存在以下问题：第一，酶法破壁存在产物抑制酶活问题，导致破壁率和提取率低，酶解时间长；第二，脱色中使用活性炭的脱色能力有限，导致得到的dha的颜色深。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，能够提高破壁率和提取率，缩短酶解时间，充分去除dha中的色素。
2、为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
3、一种从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，由以下步骤组成：酶解，提取，脱胶，脱酸，脱色，脱臭；
4、所述酶解，将裂殖壶菌发酵液、碱性蛋白酶、酶解助剂混合后，将ph调节至8-9，在50-60℃下以150-200rpm的搅拌速度搅拌2.5-3h，得到酶解破壁液；
5、所述酶解中，裂殖壶菌发酵液、酶解助剂的质量比为1000:14-15；
6、碱性蛋白酶、裂殖壶菌发酵液干物质的质量比为0.9-1:100；
7、所述碱性蛋白酶的酶活为50万u/g；
8、所述酶解助剂的制备方法，由以下步骤组成：制备羧基化活性炭，接枝，交联；
9、所述制备羧基化活性炭，将活性炭、硝酸混合后，在室温下以300-400rpm的搅拌速度搅拌20-30min，在85-95℃下以300-400rpm的搅拌速度搅拌回流4-5h，以4000-5000rpm的离心速度离心8-10min，使用蒸馏水清洗沉淀物3-4次，在120-130℃下干燥9-10h，得到羧基化活性炭；
10、所述制备羧基化活性炭中，活性炭、硝酸的质量比为150-160:2800-3000；
11、所述硝酸的摩尔浓度为7mol/l；
12、所述活性炭的平均粒径为200μm，平均孔径为2nm；
13、所述接枝，将β-环糊精、羧基化活性炭、n,n-二甲基甲酰胺混合后，在80-85℃下以400-500rpm的搅拌速度搅拌回流17-19h，在室温下静置10-12h，以4000-5000rpm的离心速度离心8-10min，使用丙酮洗涤沉淀物3-4次，在80-90℃干燥18-20h，得到接枝活性炭；
14、所述接枝中，β-环糊精、羧基化活性炭、n,n-二甲基甲酰胺的质量比为50-54:12-13:1400-1600；
15、所述交联，将接枝活性炭、β-环糊精、氢氧化钠水溶液混合后，在室温下以400-500rpm的搅拌速度搅拌30-40min，滴加戊二醛水溶液，滴加结束后在室温下以400-500rpm的搅拌速度搅拌30-40min，在55-60℃下以400-500rpm的搅拌速度搅拌2.5-3h，以4000-5000rpm的离心速度离心8-10min，使用蒸馏水洗涤沉淀物3-4次，在120-130℃下干燥12-13h，得到酶解助剂；
16、所述交联中，接枝活性炭、β-环糊精、氢氧化钠水溶液、戊二醛水溶液的质量比为50-52:30-35:1000-1100:30-35；
17、氢氧化钠水溶液的摩尔浓度为0.2mol/l；
18、所述戊二醛水溶液的质量浓度为25%；
19、所述戊二醛水溶液的滴加速度为1-2g/min；
20、所述提取，将酶解破壁液与正己烷混合后，在65-70℃下以400-500rpm的搅拌速度搅拌2-2.5h，在65-70℃下静置2-3h，取油相，以10000-11000rpm的离心速度离心9-10min，取上清液，减压蒸发去除正己烷，得到dha毛油；
21、所述提取中，酶解中的裂殖壶菌发酵液与所述提取中的正己烷的质量比为1000:1900-2000；
22、所述脱胶，将柠檬酸、富马酸混合后得到混合酸，向混合酸中加入蒸馏水制成混合酸水溶液，加入dha毛油，然后在75-85℃以50-100rpm的搅拌速度搅拌50-60min，加入氢氧化钠水溶液，在室温下搅拌20-30min，升温至80-90℃，以10000-11000rpm的离心速度离心9-10min，取上清液，干燥去除水，得到脱胶后的dha毛油；
23、所述脱胶中，柠檬酸、富马酸的质量比为5:1-2；
24、dha毛油与混合酸的质量比为100:0.2-0.3，
25、dha毛油与氢氧化钠水溶液的质量比为100:2.5-3；
26、所述混合酸水溶液的质量浓度为14-15%；
27、所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为5%；
28、所述脱酸，将脱胶后的dha毛油与氢氧化钠水溶液混合，在35-40℃下以50-100rpm的搅拌速度搅拌50-60min，升温至80-90℃，以10000-11000rpm的离心速度离心9-10min，取上清液，加入温度为80-90℃的蒸馏水，在室温下搅拌20-30min，以10000-11000rpm的离心速度离心9-10min，取上清液，干燥去除水，得到脱酸后的dha毛油；
29、所述脱酸中，脱胶后的dha毛油与氢氧化钠水溶液的质量比为100:2.5-3；
30、脱胶后的dha毛油与温度为80-90℃的蒸馏水的质量比为100:7-8；
31、所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为5%；
32、所述脱色，将脱酸后的dha毛油、脱色剂混合，在室温下以50-100rpm的搅拌速度搅拌30-40min，以10000-11000rpm的离心速度离心9-10min，取上清液，得到脱色后的dha毛油；
33、所述脱色中，脱酸后的dha毛油与脱色剂的质量比为100:5-6；
34、所述脱色剂的制备方法，由以下步骤组成：一级包覆，二级包覆；
35、所述一级包覆，将酸性硅溶胶与蒸馏水混合后，在室温下以200-300rpm的搅拌速度搅拌20-30min，加入活性炭，在室温下以200-300rpm的搅拌速度搅拌3.5-4h，在室温下静置17-20h，以4000-5000rpm的离心速度离心8-10min，使用蒸馏水清洗3-4次，在120-130℃下干燥10-12h，得到一级包覆活性炭；
36、所述一级包覆中，酸性硅溶胶、蒸馏水、活性炭的质量体积比为95-100:370-400:40-42；
37、所述酸性硅溶胶中二氧化硅的质量含量为30%，ph为3，平均粒径为10nm；
38、所述活性炭的平均粒径为200μm，平均孔径为2nm；
39、所述二级包覆，将碱性硅溶胶与蒸馏水混合后，在室温下以200-300rpm的搅拌速度搅拌15-25min，加入一级包覆活性炭，在室温下以200-300rpm的搅拌速度搅拌2.5-3h，在室温下静置12-13h，以3000-4000rpm的离心速度离心8-10min，使用蒸馏水清洗3-4次，在120-130℃下干燥14-15h，得到脱色剂；
40、所述二级包覆中，碱性硅溶胶、蒸馏水、一级包覆活性炭的质量比为85-90:370-400:54-57；
41、所述碱性硅溶胶中二氧化硅的质量含量为20%，ph为9，平均粒径为40nm；
42、所述脱臭，在温度为140-150℃、真空度为200-400pa下，向脱色后的dha毛油中通入温度为90-100℃的蒸汽，连续通入30-40min，得到dha藻油。
43、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
44、（1）本发明的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，针对于现有技术，改进之处为在酶解步骤中加入了酶解助剂，及在脱色步骤中加入了经过两级包覆的脱色剂。其中，酶解助剂的制备方法包括制备羧基化活性炭、接枝、交联，制备羧基化活性炭为使用硝酸对活性炭进行表面处理，引入羧基；接枝为将β-环糊精与羧基化活性炭混合，在高温下进行搅拌回流，β-环糊精中的羟基与羧基化活性炭中的羧基发生酯化反应，引入β-环糊精，从而将β-环糊精固定于羧基化活性炭表面，得到接枝活性炭；交联为将接枝活性炭加入含有β-环糊精的碱性溶液中，分散均匀后，滴加戊二醛水溶液，在戊二醛的作用下，β-环糊精与接枝活性炭表面的β-环糊精进行交联，在接枝活性炭表面形成β-环糊精交联网络，得到具有核壳结构的酶解助剂，酶解助剂的核为具有吸附作用的活性炭，壳为β-环糊精交联网络。在酶解步骤中，碱性蛋白酶均匀吸附于β-环糊精交联网络表面，在搅拌中能够增加与裂殖壶菌的接触面积，促进碱性蛋白酶的酶解，酶解后得到的氨基酸由于分子量小，能够通过β-环糊精交联网络后吸附于活性炭表面，不溶于水的氨基酸和部分不溶于水的脂肪酸还能够包合于β-环糊精的空腔中，从而降低了裂殖壶菌发酵液中氨基酸的浓度，降低了产物抑制作用，进一步缩短了酶解时间，提高了破壁率；在提取步骤中，加入正己烷并在高温下进行搅拌，从而促进包合于β-环糊精中脂肪酸的释放，避免对总酯提取率的影响。脱色剂的制备方法包括一级包覆和二级包覆，一级包覆为使用平均粒径为10nm的酸性硅溶胶对活性炭进行一级包覆，由于酸性硅溶胶的平均粒径大于活性炭的孔径，因此在一级包覆时不会堵塞活性炭的孔隙，而是在活性炭表面形成一层多孔二氧化硅，二级包覆为使用平均粒径为40nm的碱性硅溶胶对一级包覆活性炭进行包覆，利用碱性硅溶胶与酸性硅溶胶的带电性质不同，将碱性硅溶胶吸附于一次包覆活性炭表面，且由于碱性硅溶胶的平均粒径大于一级包覆中形成的多孔二氧化硅的孔径，从而在一级包覆活性炭表面形成一层多孔二氧化硅，得到脱色剂，脱色剂具有三层具有不同孔径的多孔结构，在吸附色素时，能够分别对小分子色素和大分子色素进行固定，从而提高对色素的固定能力，且由于二氧化硅与活性炭的材质不同，对于不同色素的吸附能力也不同，将二氧化硅与活性炭复合后，能够提高对色素的吸附范围，从而提高对色素的吸附能力，改善dha藻油的外观，进一步吸附更多的色素，导致得到的dha藻油的重量降低，但是对dha藻油中dha的质量不会造成影响；
45、（2）本发明的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，能够提高破壁率，缩短酶解时间，在酶解步骤中需要的酶解时间为2.5-3h，得到的酶解破壁液的破壁率能够达到98.7-100%；
46、（3）本发明的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，能够提高提取率，得到的dha藻油的总酯提取率为86.6-88.9%，其中，dha的质量含量为46.4-47.1%；
47、（4）本发明的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，能够充分去除dha中的色素，得到金黄色的dha藻油。
1.一种从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，其特征在于，由以下步骤组成：酶解，提取，脱胶，脱酸，脱色，脱臭；
2.根据权利要求1所述的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，其特征在于，所述酶解中，裂殖壶菌发酵液、酶解助剂的质量比为1000:14-15；
3.根据权利要求1所述的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，其特征在于，所述制备羧基化活性炭中，活性炭、硝酸的质量比为150-160:2800-3000；
4.根据权利要求1所述的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，其特征在于，所述接枝中，β-环糊精、羧基化活性炭、n,n-二甲基甲酰胺的质量比为50-54:12-13:1400-1600。
5.根据权利要求1所述的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，其特征在于，所述交联中，接枝活性炭、β-环糊精、氢氧化钠水溶液、戊二醛水溶液的质量比为50-52:30-35:1000-1100:30-35；
6.根据权利要求1所述的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，其特征在于，所述提取，将酶解破壁液与正己烷混合后，在65-70℃下搅拌2-2.5h，在65-70℃下静置2-3h，取油相，离心，取上清液，减压蒸发去除正己烷，得到dha毛油；
7.根据权利要求1所述的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，其特征在于，所述脱胶，将柠檬酸、富马酸混合后得到混合酸，向混合酸中加入蒸馏水制成混合酸水溶液，加入dha毛油，然后在75-85℃搅拌50-60min，加入氢氧化钠水溶液，在室温下搅拌20-30min，升温至80-90℃，离心，取上清液，干燥去除水，得到脱胶后的dha毛油；
8.根据权利要求1所述的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，其特征在于，所述脱酸，将脱胶后的dha毛油与氢氧化钠水溶液混合，在35-40℃下搅拌50-60min，升温至80-90℃，离心，取上清液，加入温度为80-90℃的蒸馏水，在室温下搅拌20-30min，离心，取上清液，干燥去除水，得到脱酸后的dha毛油；
9.根据权利要求1所述的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，其特征在于，所述脱色中，脱酸后的dha毛油与脱色剂的质量比为100:5-6；
10.根据权利要求1所述的从海洋微藻发酵液中提取、精炼dha的方法，其特征在于，所述脱臭，在温度为140-150℃、真空度为200-400pa下，向脱色后的dha毛油中通入温度为90-100℃的蒸汽，连续通入30-40min，得到dha藻油。
