本发明属于分子生物和医药，具体涉及一种富含细胞外囊泡的血小板裂解液的制备方法及其应用。
背景技术：
1、血小板含有三种主要的颗粒：α颗粒、致密颗粒和溶酶颗粒。α颗粒是血小板内最大和最多的分泌型颗粒，含有血管和组织形成过程中的重要生长因子。血小板在活化时会释放各种血小板源性细胞因子，包括血小板衍生生长因子(pdgf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、转化生长因子(tgf–β)、血管内皮细胞生长因子 (vegf)，这些生长因子可以刺激成纤维细胞、平滑肌细胞和造骨细胞的增殖，并能吸引多种细胞成分参与损伤组织的修复。血小板裂解液(platelet lysate, pl)是采用人工手段释放血小板内丰富的活性因子获得的一种血小板衍生产品。血小板裂解液的制备目前主要采取反复冻融，其次是通过添加凝血酶或钙离子等几种方法来进行制备。凝血酶和钙离子是血小板的生理激活物质，也是有效的激活物。但是凝血酶主要来源于牛，出于安全性的考虑，人们一直在寻找更优越的激活方法。反复冻融是在破坏细胞膜释放活性产物的同时，也会对这些物质产生不同程度的破坏，主要取决于冻融循环的次数。细胞外囊泡(evs)是从细胞质膜(微囊或微粒)或细胞内小体(外泌体)释放出来的膜小泡。它们由血小板激活后产生，在炎症、癌症进展、天然防御、组织修复、血栓形成和神经生物学中发挥着重要作用。血小板衍生ev(pevs)运输不同的货物(如rna、脂类和蛋白质)，这些货物可以转移到受体细胞。pevs的治疗潜力在被挖掘，它们可以在不同的出血和创伤动物模型中促进凝血和血管生成。此外，pevs已被发现对治疗慢性损伤和创伤是有益的。目前在对血小板裂解液进行制备的工艺，少有考虑同时提升细胞外囊泡(evs）含量。
技术实现思路
1、因此，基于以上背景，本发明提供了一种富含细胞外囊泡的血小板裂解液的制备方法及其应用，本发明所制备的血小板裂解液中，细胞外囊泡含量高，可为血小板裂解液的进一步地开发应用提供方向。
2、本发明的技术方案为：
3、一种富含细胞外囊泡的血小板裂解液的制备方法，其包括如下步骤：
4、s1：取全血，加入抗凝管后，去除红细胞，制备浓缩血小板；
5、s2：采用含acd抗凝剂的hepes缓冲液洗涤及其重悬血小板，所述 acd的质量浓度为0.3%；
6、s3：冰水浴下对步骤s2的血小板重悬液进行间歇式超声裂解；
7、s4：将步骤s3的裂解液在4℃下离心，收集上清即为富含细胞外囊泡的血小板裂解液。
8、进一步地，步骤s3的间歇式超声裂解的条件为：超声处理5s，停止5s，循环30次，超声功率100w。
9、进一步地，步骤s1中去除红细胞，制备浓缩血小板的操作如下：
10、1）将血浆在室温下离心，取血浆和白膜层；
11、2）将步骤1）的血浆和白膜层在室温下离心后，取沉淀，即可。
12、进一步地，步骤s2所制备的重悬液中血小板的浓度为1000×109/l。
13、基于同一发明构思，本发明提供出一种采用上述的制备方法所制备得到的富含细胞外囊泡的血小板裂解液。
14、基于同一发明构思，本发明将上述制备方法制备的富含细胞外囊泡的血小板裂解液应用于细胞培养。
15、进一步地，所述细胞包括人脐静脉血管内皮细胞。
16、基于同一发明构思，本发明将上述制备方法所制备的富含细胞外囊泡的血小板裂解液应用于制备细胞外囊泡。
17、进一步地，所述细胞外囊泡的制备操作如下：
18、①取富含细胞外囊泡的血小板裂解液，离心，取上清液；
19、②对步骤1）获得的上清液进行再次离心后，取沉淀，即可。
20、基于同一发明构思，本发明提供一种采用上述制备的过富含细胞外囊泡的血小板裂解液所制备的细胞外囊泡。
21、进一步地，所述细胞外囊泡可应用于制备可促进创面愈合制剂中。
22、采取上述技术方案，具有的有益效果如下：
23、1）本发明通过间歇式超声裂解制备的血小板裂解液的工艺中，无需外源添加凝血酶、胶原或者 ca离子等生物化学成分，更为简便、安全。
24、2）本发明通过合理的超声工艺参数的设置，所制备的血小板裂解液中不仅富含各种因子（例如bfgf、vegf、pdgf-bb等，及其il-6、il-15、il-17以及inf-γ）和生物活性蛋白含量高。
25、本发明所制备的血小板裂解液中细胞外囊泡不仅含量高，且直径小，细胞外囊泡的平均直径可低至79.9nm，外泌体的占比比较大，且细胞外囊泡的跨膜蛋白cd9高表达，cd81低表达。
26、3）并本发明所制备的血小板裂解液可通过浓缩纯化，制备细胞外囊泡制品，可为血小板细胞外囊泡相关产品的制备提供新的思路与方向。
1.一种富含细胞外囊泡的血小板裂解液的制备方法，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的一种富含细胞外囊泡的血小板裂解液的制备方法，其特征在于，步骤s3的间歇式超声裂解的条件为：超声处理5s，停止5s，循环30次，超声功率100w。
3.根据权利要求1所述的一种富含细胞外囊泡的血小板裂解液的制备方法，其特征在于，步骤s1中去除红细胞，制备浓缩血小板的操作如下：
4.根据权利要求3所述的一种富含细胞外囊泡的血小板裂解液的制备方法，其特征在于，步骤s2所制备的重悬液中血小板的浓度为1000×109/l。
5.采用权利要求1至4任一项所述的制备方法所制备得到的富含细胞外囊泡的血小板裂解液。
6.权利要求5所述的富含细胞外囊泡的血小板裂解液在细胞培养中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞包括人脐静脉血管内皮细胞。
8.权利要求5所述的富含细胞外囊泡的血小板裂解液在制备细胞外囊泡中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞外囊泡的制备操作如下：
