本发明涉及化合物生物技术生产领域，尤其是一种次黄嘌呤生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术：
1、次黄嘌呤的英文学名为hypoxanthine，它的常见分子式是c5h4n4o，分子量为136.11，是一种由c 44.12%, h 2.96%, n 41.16%, o 11.75%构成的化合物。
2、次黄嘌呤是一种非常重要的生物嘌呤碱，在人体内分布广泛，能够参与调节人体内的一些重要生理机能，具有降低血压、平喘、治疗痛风等药理活性，还可用于治疗各种原因所致的白细胞减少症、血小板减少症等疾病，被广泛应用于医疗方面。次黄嘌呤的6-羟基活性很高，其衍生物（如6-巯基嘌呤）被用作抗癌药物和植物生长调节剂。此外，嘌呤化合物可用作干扰素释放的诱导剂、促肾上腺皮质激素受体的配体和腺苷受体激动剂的拮抗剂,还可用于治疗各种原因所致的白细胞减少症、血小板减少症等疾病；同时，次黄嘌呤也是合成抗恶性肿瘤药6-巯嘌呤和硫唑嘌呤的重要中间体。
3、近年来，国内外对次黄嘌呤的需求量达到500~1000吨/年，并伴随有持续增长的趋势，而目前国内产能还达不到需求量的一半。现阶段次黄嘌呤主要通过肌苷水解法获得，生产成本较高，每吨市场价格高达13万元左右，微生物发酵法成本低廉，因此，开发出一株高产次黄嘌呤生产菌株具有十分重要的应用价值。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种次黄嘌呤生产菌株。
2、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述次黄嘌呤生产菌株的构建方法。
3、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述次黄嘌呤生产菌株的应用。
4、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
5、一种次黄嘌呤生产菌株，为菌株 e. coli-hxz18，是经人工改造、具有特定基因型的 e. coli w3110（大肠杆菌w3110）：在出发菌株 e.coli-hxz12基因组中上调了菌株 e. coli-hxz12的 glna和 aspc基因的转录水平，下调了菌株 e. coli-hxz12的 thra和 pgi基因的转录水平，缺失了 edd基因，引入了 escherichia colik-12 mg1655（大肠杆菌k-12 mg1655，购自江苏天净沙基因诊断技术有限公司）来源的 nepi基因（转运蛋白）。
6、上述出发菌株 e. coli-hxz12的专利号为cn202311064459.3（一种生产次黄嘌呤的基因工程菌及其构建方法与应用）实施例中菌株 e.coli-hxz12。
7、优选的，上述次黄嘌呤生产菌株，在 yeel位点上整合glna基因，并用trc启动子调控;在yeep位点上整合 aspc基因，并用lac启动子调控;将thra基因的天然启动子替换为pbba_j23109;将pgi基因的天然启动子替换为pbba_j23105;在ilvg位点上整合nepi基因，并用trc启动子调控。
8、优选的，上述次黄嘌呤生产菌株，所述lac启动子的核苷酸序列如序列表seq idno.1所示，所述trc启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示，所述pbba_j23109启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示，所述pbba_j23105启动子的核苷酸序列如序列表seqid no.4所示，所述 glna基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示，所述 aspc基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示，所述 thra基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示，所述 pgi基因的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示，所述 edd基因的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示，所述 nepi基因的核苷酸序列如序列表seq id no.10所示。
9、上述生产次黄嘌呤的基因工程菌的构建方法，以 e. coli-hxz12作为出发菌株，利用代谢工程手段进行基因编辑，具体步骤如下：
10、（1）强化前体物供应：以 e.coli-hxz12为出发菌株，将 glna基因整合至基因组 yeel假基因位点上，并利用trc启动子强化表达；将 aspc基因过表达至基因组y eep假基因位点上，并利用lac启动子强化表达；将 thra基因的天然启动子替换为pbba_j23109；
11、（2）弱化磷酸戊糖途径的分支途径：在基因组上敲除 edd基因，将 pgi基因的天然启动子替换为pbba_j23105；
12、（3）次黄嘌呤输出系统的改造：将 escherichia coli k-12 mg1655来源的 nepi基因整合至基因组 ilvg假基因位点上，并利用trc启动子强化表达。
13、上述次黄嘌呤生产菌株在发酵生产次黄嘌呤方面的应用。
14、优选的，上述次黄嘌呤生产菌株的应用，使用机械搅拌式发酵罐发酵生产次黄嘌呤，具体步骤如下：
15、（1）种子活化：菌种均匀涂布于活化斜面，37℃培养13 h，转接新的斜面继续培养11 h；
16、（2）种子培养：将菌悬液接入种子培养基中，ph 6.8，温度恒定在35℃，溶氧在40%-60%，培养14h；
17、（3）发酵培养：等待种子菌体量od600至20-25，按照20%接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制ph 7.0，温度37℃，溶氧在40%-60%；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80%的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在1 g/l以下。
18、优选的，上述次黄嘌呤生产菌株的应用，所述种子活化中采用的斜面培养基为：葡萄糖4 g/l，蛋白胨4g/l，酵母浸出粉8 g/l，氯化钠3 g/l，磷酸二氢钾4 g/l，无水硫酸镁2g/l，琼脂粉20%（体积百分比），其余为水，ph 7.0。
19、优选的，上述次黄嘌呤生产菌株的应用，所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖25 g/l，酵母浸出粉6 g/l，蛋白胨3 g/l，硫酸铵5 g/l，磷酸二氢钾3 g/l，无水硫酸镁0.5 g/l，七水硫酸亚铁40 mg/l，一水硫酸锰20 mg/l，vh0.5 mg/l，vb11 mg/l，鸟嘌呤0.5g/l，其余为水；于115℃高压蒸汽锅灭菌25 min。
20、优选的，上述次黄嘌呤生产菌株的应用，所述发酵培养中采用的发酵培养基为：葡萄糖30g/l，酵母浸出粉6 g/l，蛋白胨4 g/l，硫酸铵3 g/l，磷酸二氢钾3 g/l，无水硫酸镁2g/l，七水硫酸亚铁40 mg/l，一水硫酸锰10 mg/l，vh1mg/l，vb12 mg/l，鸟嘌呤1 g/l，其余为水；于115℃高压蒸汽锅灭菌25 min。
21、上述培养基均可采用标准方法制备获得。
22、有益效果：
23、上述次黄嘌呤生产菌株，在菌株 e.coli-hxz12的基础上继续菌种改造，获得的菌株强化了 e.coli-hxz12的前体物供应模块，通过加强谷氨酰胺合成酶的表达，提高前体物谷氨酰胺的供应；通过加强天冬氨酸转氨酶的表达，并弱化天冬氨酸分支途径的关键作用酶天冬氨酸激酶，提高前体物天冬氨酸的供应；通过弱化磷酸戊糖途径的分支途径，弱化葡萄糖磷酸异构酶，敲除编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶的 edd基因，使更多的代谢流进入磷酸戊糖途径；通过引入 escherichia colik-12 mg1655来源的次黄嘌呤外排蛋白基因，使次黄嘌呤能够更通畅地输出至胞外，使菌株具有高效的次黄嘌呤输出能力，最终得到的 e. coli- hxz18遗传背景清晰、发酵过程稳定，可高产次黄嘌呤，具有良好的应用前景。
1.一种次黄嘌呤生产菌株，其特征在于：是在出发菌株e.coli-hxz12基因组中上调了菌株e. coli-hxz12的glna和aspc基因的转录水平，下调了菌株e. coli-hxz12的thra和pgi基因的转录水平，缺失了edd基因，引入了escherichia coli k-12 mg1655来源的nepi基因获得的。
2.根据权利要求1所述的次黄嘌呤生产菌株，其特征在于：在yeel位点上整合glna基因，并用trc启动子调控;在yeep位点上整合 aspc基因，并用lac启动子调控;将thra基因的天然启动子替换为 pbba_j23109;将pgi基因的天然启动子替换为pbba_j23105;在ilvg位点上整合nepi基因，并用trc启动子调控。
3.根据权利要求2所述的次黄嘌呤生产菌株，其特征在于：所述lac启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示，所述trc启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示，所述pbba_j23109启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示，所述pbba_j23105启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示，所述glna基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示，所述aspc基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示，所述thra基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示，所述pgi基因的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示，所述edd基因的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示，所述nepi基因的核苷酸序列如序列表seq idno.10所示。
4.权利要求1-3之一所述生产次黄嘌呤的基因工程菌的构建方法，其特征在于：以e. coli-hxz12作为出发菌株，具体步骤如下：
5.权利要求1-3之一所述次黄嘌呤生产菌株在发酵生产次黄嘌呤方面的应用。
6.根据权利要求5所述次黄嘌呤生产菌株的应用，其特征在于：使用发酵罐发酵生产次黄嘌呤，具体步骤如下：
7.根据权利要求6所述次黄嘌呤生产菌株的应用，其特征在于：种子活化中采用的斜面培养基为：葡萄糖4 g/l，蛋白胨4g/l，酵母浸出粉8 g/l，氯化钠3 g/l，磷酸二氢钾4 g/l，无水硫酸镁2 g/l，琼脂粉20%，其余为水。
8.根据权利要求6所述次黄嘌呤生产菌株的应用，其特征在于：种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖25 g/l，酵母浸出粉6 g/l，蛋白胨3 g/l，硫酸铵5 g/l，磷酸二氢钾3 g/l，无水硫酸镁0.5 g/l，七水硫酸亚铁40 mg/l，一水硫酸锰20 mg/l，vh 0.5 mg/l，vb1 1mg/l，鸟嘌呤0.5 g/l，其余为水。
9.根据权利要求6所述次黄嘌呤生产菌株的应用，其特征在于：发酵培养中采用的发酵培养基为：葡萄糖30g/l，酵母浸出粉6 g/l，蛋白胨4 g/l，硫酸铵3 g/l，磷酸二氢钾3 g/l，无水硫酸镁2g/l，七水硫酸亚铁40 mg/l，一水硫酸锰10 mg/l，vh 1mg/l，vb1 2 mg/l，鸟嘌呤1 g/l，其余为水。
