本发明涉及生化检测，尤其涉及一种β-羟基丁酸检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
1、β-羟基丁酸( bhb) 是肝脏脂肪酸氧化分解的中间产物，是酮体的主要成分。而酮体能够为人体提供能量，一般是在机体不能正常利用葡萄糖或缺乏葡萄糖，无法正常供能时，机体就会代偿性地产生酮体替代，以维持能量供应。临床上，β-羟基丁酸的含量可以用于诊断糖尿病酮酸中毒症状。此外，β-羟基丁酸的含量还能用于鉴定蛋制品和肉制品的新鲜程度。
2、目前检测β-羟基丁酸主要有两种方法。一种为实验室常用方法，即利用β-羟丁酸脱氢酶催化β-羟丁酸产生乙酰乙酸，同时将nad还原为nadh，通过检测nadh的生成量来计算β-羟丁酸的含量，但是nadh的吸光值变化通常比较小，灵敏度低，并且该还原反应是一个可逆反应，尤其是当样本含量较低时，很容易受到逆反应或者其它干扰导致测定值不稳定。且此反应物无颜色变化，反应结果不够直观，无法通过颜色简单判断样本含量。另一种为商业试剂盒方法，即利用β-羟丁酸脱氢酶催化β-羟丁酸产生乙酰乙酸，同时还原nad为nadh的基础上，加入黄递酶与氯化碘硝基四氮唑，通过黄递酶催化nadh与氯化碘硝基四氮唑反应产生甲瓒染料，检测492nm下吸光值增加量来计算β-羟基丁酸含量。这种方法解决了实验室方法容易受到逆反应干扰的问题，灵敏度也较高。但是现有的商业试剂盒方法需要使用到两种酶，实验成本较高，并且氯化碘硝基四氮唑在水中的溶解度很低，化学稳定性较差，极易影响到反应的稳定性和线性范围。
技术实现思路
1、为克服上述缺点，本发明的目的在于提供一种β-羟基丁酸检测试剂盒及其检测方法，能在降低实验成本的同时，保证检测的灵敏度及稳定性，使得检测结果更加准确。
2、为了达到以上目的，本发明采用的技术方案之一是：一种β-羟基丁酸检测试剂盒，包括蛋白质沉淀剂、基质缓冲液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-羟丁酸脱氢酶、显色溶液，其中，
3、所述蛋白质沉淀剂包括铁氰化钾水溶液、硫酸锌水溶液和氢氧化钠水溶液；
4、所述显色溶液包括由1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲硫酸盐、2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二磺基苯）-2h-四氮唑单钠盐和氯化钠配置而成的溶液。
5、本发明检测试剂盒的有益效果在于：
6、在蛋白质沉淀剂中，采用铁氰化钾、硫酸锌和氢氧化钠的水溶液能利用多种沉淀剂增强对样本上的蛋白质等杂质的去除效果，利于样本的后续处理；
7、在显色溶液中，采用2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二磺基苯）-2h-四氮唑单钠盐（即cas 193149-74-5）作为显色剂，通过检测反应产生的橙黄色产物来测定β-羟基丁酸的含量，吸光值变化更加明显，进而解决了传统实验室方法灵敏度低、稳定性差的问题，同时相较于现有的商业试剂盒中使用氯化碘硝基四氮唑而言，溶解性更好，化学稳定性更强；且使用1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲硫酸盐（即cas 65162-13-2）作为非酶电子载体，相较于现有的商业试剂盒中使用黄递酶而言，成本更低，更方便保存。
8、进一步来说，在所述蛋白质沉淀剂中，所述铁氰化钾水溶液的浓度为30~40g/l，所述硫酸锌水溶液的浓度为60~80g/l，所述氢氧化钠水溶液的浓度为2~6g/l。
9、进一步来说，所述基质缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液和防腐剂，所述防腐剂为5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的混合物；所述三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液的浓度为0.1~0.2mol/l，所述防腐剂在所述基质缓冲液中的占比为0.03~0.05%。
10、进一步来说，在所述显色溶液中，所述2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二磺基苯）-2h-四氮唑单钠盐的浓度为3~6mg/ml，所述1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲硫酸盐的浓度为0.05~0.2mg/ml。
11、进一步来说，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为4~8g/l，所述β-羟丁酸脱氢酶的浓度为200~300u/ml。
12、本发明采用的技术方案之二是：一种β-羟基丁酸检测试剂的检测方法，包括如下步骤：
13、s1、使用蛋白质沉淀剂对待测样本进行处理，以获得样本上清液；
14、s2、使用基质缓冲液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-羟丁酸脱氢酶和显色溶液来配制测定工作液与对照工作液；
15、s3、绘制β-羟基丁酸吸光值标准曲线；
16、s4、分别使用测定工作液、对照工作液与样本上清液进行混合反应，并分别测定反应后的反应液吸光值；然后根据反应液吸光值的差值对照β-羟基丁酸吸光值标准曲线以计算出待测样本中β-羟基丁酸的含量。
17、本发明检测方法的有益效果在于：
18、通过在步骤s2中提前配制测定工作液和对照工作液，使得后续的检测操作更加简便，样本重复性更好，更适于大批量的样本测定，且对照工作液的设置能充分排除样本杂质的干扰，使得检测准确性更好。
19、进一步来说，步骤s1包括：在待测样本中加入适量水充分混匀后，分步加入氰化钾水溶液、硫酸锌水溶液和氢氧化钠水溶液，混匀后离心获取样本上清液。
20、进一步来说，步骤s2包括：取部分基质缓冲液分别溶解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羟丁酸脱氢酶，然后将溶解后的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、溶解后的β-羟丁酸脱氢酶、基质缓冲液和显色溶液按设定的比例混合，并分别配制成测定工作液与对照工作液。
21、进一步来说，步骤s3包括：步骤s3包括：称取β-羟基丁酸并均分为多份，用不同量的蒸馏水对多份β-羟基丁酸分别进行溶解，以配制成不同浓度的标准品溶液；采用测定工作液、对照工作液分别与同浓度的标准品溶液反应，并在37℃反应一段时间后，测定450nm波长下的吸光值差值；然后根据不同浓度的标准品溶液的吸光值差值绘制标准曲线。
22、进一步来说，步骤s4包括：在酶标板上分别标定测定管和对照管，并向测定管、对照管内加入等量的样本上清液；然后向测定管内加入测定工作液，向对照管内加入对照工作液，在37℃反应一段时间后，分别测定测定管、对照管内的反应液在450nm波长下的吸光值；然后根据测定管、对照管内的反应液的吸光值差值对照标准曲线并计算出待测样本中β-羟基丁酸的含量。
1.一种β-羟基丁酸检测试剂盒，其特征在于，包括蛋白质沉淀剂、基质缓冲液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-羟丁酸脱氢酶、显色溶液，其中，
2.根据权利要求1所述的β-羟基丁酸检测试剂盒，其特征在于，在所述蛋白质沉淀剂中，所述铁氰化钾水溶液的浓度为30~40g/l，所述硫酸锌水溶液的浓度为60~80g/l，所述氢氧化钠水溶液的浓度为2~6g/l。
3.根据权利要求1所述的β-羟基丁酸检测试剂盒，其特征在于，所述基质缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液和防腐剂，所述防腐剂为5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的混合物；所述三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液的浓度为0.1~0.2mol/l，所述防腐剂在所述基质缓冲液中的占比为0.03~0.05%。
4.根据权利要求1所述的β-羟基丁酸检测试剂盒，其特征在于，在所述显色溶液中，所述2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二磺基苯）-2h-四氮唑单钠盐的浓度为3~6mg/ml，所述1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲硫酸盐的浓度为0.05~0.2mg/ml。
5.根据权利要求1所述的β-羟基丁酸检测试剂盒，其特征在于，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为4~8g/l，所述β-羟丁酸脱氢酶的浓度为200~300u/ml。
6.一种β-羟基丁酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的β-羟基丁酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤s1包括：在待测样本中加入适量水充分混匀后，分步加入氰化钾水溶液、硫酸锌水溶液和氢氧化钠水溶液，混匀后离心获取样本上清液。
8.根据权利要求6所述的β-羟基丁酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤s2包括：取部分基质缓冲液分别溶解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羟丁酸脱氢酶，然后将溶解后的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、溶解后的β-羟丁酸脱氢酶、基质缓冲液和显色溶液按设定的比例混合，并分别配制成测定工作液与对照工作液。
9.根据权利要求6所述的β-羟基丁酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤s3包括：称取β-羟基丁酸并均分为多份，用不同量的蒸馏水对多份β-羟基丁酸分别进行溶解，以配制成不同浓度的标准品溶液；采用测定工作液、对照工作液分别与同浓度的标准品溶液反应，并在37℃反应一段时间后，测定450nm波长下的吸光值差值；然后根据不同浓度的标准品溶液的吸光值差值绘制标准曲线。
10.根据权利要求6所述的β-羟基丁酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤s4包括：在酶标板上分别标定测定管和对照管，并向测定管、对照管内加入等量的样本上清液；然后向测定管内加入测定工作液，向对照管内加入对照工作液，在37℃反应一段时间后，分别测定测定管、对照管内的反应液在450nm波长下的吸光值；然后根据测定管、对照管内的反应液的吸光值差值对照标准曲线并计算出待测样本中β-羟基丁酸的含量。
