本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关的病原体的引物探针组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术：
1、腹泻病是由多种病原体和因素引起的一组以大便性状改变为特征的疾病。急性感染性腹泻病定义为由体内或病原微生物感染引起的病程不足2周的腹泻病。急性感染性腹泻病发病率高，流行范围广，严重危害儿童健康。由于其发病率高，对儿童健康危害大，是儿童营养不良、生长发育障碍和死亡的重要原因之一。该病的临床表现主要有消化道症状、全身症状及水、电解质及酸碱平衡紊乱。具体表现为大便性状改变，如稀糊便、水样便、黏液便、脓血便；大便次数增多，每日3次以上，甚至10～20次/日；伴有恶心、呕吐、腹痛、腹胀、食欲不振、发热、烦躁、精神萎靡、嗜睡，也可伴有心、脑、肝、肾等其他器官系统受累表现。严重时不同程度的脱水、代谢性酸中毒、低钾血症、低钠或高钠血症，也可有低钙血症、低镁血症。
2、儿童急性感染性腹泻病诊疗规范(2020年版)明确指出该病的病原体包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。细菌中常见产毒性大肠埃希菌(etec)、致病性大肠埃希菌(epec)、侵袭性大肠埃希菌(eiec)、出血性大肠埃希菌(ehec)、黏附性大肠埃希菌(eaec)、空肠弯曲菌(cje)、鼠伤寒沙门菌(styp)、肠炎沙门菌(se)、o1群霍乱弧菌(vc o1)、o139群霍乱弧菌(vco139)、志贺菌(sd)、小肠结肠炎耶尔森菌(yent)、艰难梭菌(cdiff)、金黄色葡萄球菌(sa)和副溶血性弧菌(vp)；真菌中常见念珠菌(ca)、毛霉菌(muc)和曲霉菌(as)；寄生虫中常见隐孢子虫(cryp)、蓝氏贾第鞭毛虫(gial)、溶组织内阿米巴(enhs)和人芽囊原虫(bh)。
3、由于引起腹泻的病原体多，且临床体征难以区分，因此，病原的准确鉴别分析对于医生或患者尽早及时的制定合理的医疗方案具有重要意义。在感染性疾病领域，准确诊断是精准防控的前提。在缺乏病原信息的情况下及时准确地确定腹泻病感染病原的类型，便于抗生素的规范使用。
4、现有的腹泻病原体检测方法中，经典的病原体检测技术为病原体的分离培养，但操作步骤繁琐，条件要求较高，检测周期长，且实验安全性和结果准确性相对难以保证。免疫学检测法常采用酶联免疫吸附试验，但耗时较长、操作繁琐、灵敏度低、假阳性高等限制了其在临床上的参考价值。目前，许多分子生物学技术应用到腹泻病原体的检测中，如聚合酶链式反应(pcr)、高通量测序等，然而这些技术有其自身的应用缺点，且依赖大型仪器设备，费用昂贵，不适合大规模筛查。普通qpcr(荧光-探针法)平台检测虽然可进行多种病原体同时检测，但每台仪器最多只能检测4-6种病原，致使在检测多基因时，需要分别配制对应的试剂，且每一种试剂都需要单独加一次模板，这样就会使检测样本模板量增加，其对应的检测试剂成本增加且操作繁琐，无法满足临床检测需求，尤其是儿童急性感染性腹泻病相关病原体种类较多，要做到尽可能多的病原体类型的检测，不仅检测成本高，而且要多次操作，较为繁琐。
5、因此，目前迫切需要一种能够实现多种儿童急性感染性腹泻病相关病原的快速同时检测的方法，这对感染性腹泻的临床诊断与用药具有重要的指导意义。
6、因此，现有技术有待进一步改进。
技术实现思路
1、针对现有技术中的荧光定量qpcr检测平台难以在同一管同步检测多种腹泻相关病原体的技术问题，本发明提供了一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关的病原体的引物探针组合物、试剂盒及检测方法，该引物探针组合物及其试剂盒可实现15种腹泻致病细菌的同步检测，在此基础上还可进一步实现同步检测3种致病真菌和4种寄生虫的检测，检测效率高，特异性强，灵敏度高，可应用在急性感染性腹泻病的临床检测中。
2、为解决上述问题，本技术提供以下技术方案：
3、第一方面，本技术提供一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关的病原体的引物探针组合物，包括扩增引物对及与所述扩增引物对应的探针，所述引物探针组合物包括至少10组以下分别用于检测各种腹泻致病细菌的引物探针：
4、用于检测产毒性大肠埃希菌(etec)elta基因的引物探针：如seq id no.1所示的正向引物etec-f，如seq id no.2所示的反向引物etec-r，如seq id no.3所示的荧光探针etec-p；
5、用于检测致病性大肠埃希菌(epec)eaea基因基因的引物探针：如seq id no.4所示的正向引物epec-f，如seq id no.5所示的反向引物epec-r，如seq id no.6所示的荧光探针epec-p；
6、用于检测侵袭性大肠埃希菌(eiec)的ipah基因的引物探针：如seq id no.7所示的正向引物eiec-f，如seq id no.8所示的反向引物eiec-r，如seq id no.9所示的荧光探针eiec-p；
7、用于检测出血性大肠埃希菌(ehec)的rfbe基因的引物探针：如seq id no.10所示的正向引物ehec-f，如seq id no.11所示的反向引物ehec-r，如seq id no.12所示的荧光探针ehec-p；
8、用于检测黏附性大肠埃希菌(eaec)的afa基因的引物探针：如seq id no.13所示的正向引物eaec-f，如seq id no.14所示的反向引物eaec-r，如seq id no.15所示的荧光探针eaec-p；
9、用于检测空肠弯曲菌(cje)的hipo基因的引物探针：如seq id no.16所示的正向引物cje-f，如seq id no.17所示的反向引物cje-r，如seq id no.18所示的荧光探针cje-p；
10、用于检测鼠伤寒沙门菌(styp)的fljb基因的引物探针：如seq id no.19所示的正向引物styp-f，如seq id no.20所示的反向引物styp-r，如seq id no.21所示的荧光探针styp-p；
11、用于检测肠炎沙门菌(se)的tcps基因的引物探针：如seq id no.22所示的正向引物se-f，如seq id no.23所示的反向引物se-r，如seq id no.24所示的荧光探针se-p；
12、用于检测o1群霍乱弧菌(vc o1)的rfbv基因的引物探针：如seq id no.25所示的正向引物vco1-f，如seq id no.26所示的反向引物vco1-r，如seq id no.27所示的荧光探针vco1-p；
13、用于检测o139群霍乱弧菌(vc o139)的vcm8基因的引物探针：如seq id no.28所示的正向引物vco139-f，如seq id no.29所示的反向引物vco139-r，如seq id no.30所示的荧光探针vco139-p；
14、用于检测志贺菌(sd)的ipah-teh1基因引物探针：如seq id no.31所示的正向引物sd-f，如seq id no.32所示的反向引物sd-r，如seq id no.33所示的荧光探针sd-p；
15、用于检测小肠结肠炎耶尔森菌(yent)的cadr基因的引物探针：如seq id no.34所示的正向引物yent-f，如seq id no.35所示的反向引物yent-r，如seq id no.36所示的荧光探针yent-p；
16、用于检测艰难梭菌(cdiff)的tpi基因的引物探针：如seq id no.37所示的正向引物cdiff-f，如seq id no.38所示的反向引物cdiff-r，如seq id no.39所示的荧光探针cdiff-p；
17、用于检测金黄色葡萄球菌(sa)的nuc基因的引物探针：如seq id no.40所示的正向引物sa-f，如seq id no.41所示的反向引物sa-r，如seq id no.42所示的荧光探针sa-p；
18、用于检测副溶血性弧菌(vp)的toxr基因的引物探针：如seq id no.43所示的正向引物vp-f，如seq id no.44所示的反向引物vp-r，如seq id no.45所示的荧光探针vp-p；
19、荧光探针的5’端标记荧光报告基团，荧光探针的3’端标记荧光猝灭基团。
20、实际应用中，可根据需要从上述15组引物探针中选择10组～15组的引物探针，从而实现同时对10种～15种急性感染性腹泻病相关的病原体的检测。这些病原体具体为：产毒性大肠埃希菌(etec)、致病性大肠埃希菌(epec)、侵袭性大肠埃希菌(eiec)、出血性大肠埃希菌(ehec)、黏附性大肠埃希菌(eaec)、空肠弯曲菌(cje)、鼠伤寒沙门菌(styp)、肠炎沙门菌(se)、o1群霍乱弧菌(vc o1)、o139群霍乱弧菌(vc o139)、志贺菌(sd)、小肠结肠炎耶尔森菌(yent)、艰难梭菌(cdiff)、金黄色葡萄球菌(sa)、副溶血性弧菌(vp)。
21、优选地，在上述基础上，为了同时检测致多种致病真菌(念珠菌(ca)、毛霉菌(muc)和曲霉菌(as))，所述引物探针组合物还包括以下用于检测多种腹泻致病真菌的引物探针：
22、用于检测念珠菌5.8s rrna基因的引物探针：如seq id no.46所示的正向引物ca-f，如seq id no.47所示的反向引物ca-r，如seq id no.48所示的荧光探针ca-p；
23、用于检测毛霉菌的hmgr3基因引物探针：如seq id no.49所示的正向引物muc-f，如seq id no.50所示的反向引物muc-r，如seq id no.51所示的荧光探针muc-p；
24、用于检测曲霉菌的18s rrna引物探针：如seq id no.52所示的正向引物as-f，如seq id no.53所示的反向引物as-r，如seq id no.54所示的荧光探针as-p。
25、进一步优选地，在上述基础上，为了同时检测腹泻致病寄生虫(隐孢子虫(cryp)、蓝氏贾第鞭毛虫(gial)、溶组织内阿米巴(enhs)和人芽囊原虫(bh))，所述引物探针组合物还包括以下用于检测多种寄生虫的引物探针：
26、用于检测隐孢子虫18s rrna基因的引物探针：如seq id no.55所示的正向引物cryp-f，如seq id no.56所示的反向引物cryp-r，如seq id no.57所示的荧光探针cryp-p；
27、用于检测蓝氏贾第鞭毛虫bg基因的引物探针：如seq id no.58所示的正向引物gial-f，如seq id no.59所示的反向引物gial-r，如seq id no.60所示的荧光探针gial-p；
28、用于检测溶组织内阿米巴18s rrna基因的引物探针：如seq id no.61所示的正向引物enhs-f，如seq id no.62所示的反向引物enhs-r，如seq id no.63所示的荧光探针enhs-p；
29、用于检测人芽囊原虫的gsblh基因引物探针：如seq id no.64所示的正向引物bh-f，如seq id no.65所示的反向引物bh-r，如seq id no.66所示的荧光探针bh-p。
30、该方案的引物探针组合物及其应用的试剂盒在荧光定量qpcr检测平台上能够同时检测上述22种儿童急性感染性腹泻病相关的细菌、真菌及寄生虫，检测全面，效率最高。
31、上述22组引物探针之间不仅不存在相互干扰的问题，并且每组引物探针对各自的待测位点的结合特异性高，在单孔反应管即可完成22种病原体的同步检测，极大地提高检测通量。
32、可选地，所述引物探针组合物还包括用于检测内参rnasep基因的引物探针：如seqid no.67所示的正向引物rp-f，如seq id no.68所示的反向引物rp-r，如seq id no.69所示的荧光探针rp-p。内参对照能够显示假阴性的发生，用以对待测样本的采集、运输、提取和扩增过程进行监控，避免假阴性对检测结果的干扰。
33、可选地，所述引物探针组合物中，所述荧光报告基团选自fam、rox、cy5和vic中的任一种，所述荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或bhq3。针对不同基因位点的荧光探针设置不同的荧光基团来进行区分，且通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。
34、优选地，所述引物探针组合物中，荧光探针etec-p、eaec-p、vco1-p、cdiff-p、muc-p和enhs-p5’端标记有fam荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；荧光探针eiec-p、styp-p、sd-p、vp-p和cryp-p的5’端标记有cy5荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq3；荧光探针epec-p、cje-p、vco139-p、sa-p、as-p和bh-p5’端标记有rox荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2；荧光探针ehec-p、se-p、yent-p、ca-p、gial-p和rp-p的5’端标记有vic荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1。
35、上述方案的检测原理为：针对不同病原体特异性基因的荧光探针设置不同的荧光基团以区分，并使用荧光标记报告基团和荧光淬灭基团的检测探针进行熔解曲线分析。在一定的环境温度条件下，探针与其互补序列可形成双链。此时探针上的报告基团和淬灭基团分离，不能吸收报告基团发出的信号，将检测到最强的信号。随着温度的继续升高，两条双链开始分离，使探针出现单链自由卷曲状态。此时，探针上的报告基团和淬火基团将再次接近，报告基团发出的信号将被淬灭基团吸收。因此，随着温度继续上升，测量到的信号逐渐减弱。当两个双链完全分离时，所有探针都表现为单链自由卷曲状态。此时，探针发出的所有信号都被淬灭基团吸收，探针发出的信号基本不可测。因此，通过检测双链在加热或冷却过程中发出的荧光信号，可以观察到探针与其互补序列之间的杂交分离过程，并形成随温度实时变化的信号强度曲线。通过对曲线的导数分析，得到了以信号强度变化率为纵轴，温度为横轴的熔解曲线。该曲线中的峰为熔解峰，对应的温度为双链的tm。在本文中，“熔解峰”和“tm”意思相同，可以互换使用。采用基于熔解曲线的荧光定量pcr检测技术，可根据荧光基团不同及熔解曲线的tm值进行病原体鉴别，该方法操作简单，成本低，具有较高的灵敏度和准确度。
36、第二方面，本技术还提供一种用于同步检测多种急性感染性腹泻病相关病原体的试剂盒，其包括如权利要求1～6中任一项所述的引物探针组合物。
37、可选地，所述试剂盒的扩增反应液中，正向引物的终浓度范围为0.1μm～0.2μm，反向引物的终浓度范围为2μm～4μm，探针的终浓度范围为0.2μm～0.4μm；酶混合液包括0.4u/μl taqdna聚合酶、0.002u/μl udg酶。
38、可选地，所述试剂盒包括冻干反应试剂，所述冻干反应试剂包括：如权利要求1所述的引物探针组合物、dna聚合酶、反应buffer、dntp、dutp以及冻干保护剂。
39、所述冻干反应试剂采用以下方法制备得到：将上述成分混合后进行分装后进行冻干。可选，所述冻干程序为：-45℃，预冻4h；-25℃，0.15mbar的真空条件，3h；-15℃，0.1mbar真空条件下，2.5h；0℃，0.0025mbar真空条件下，3.5h；20℃，0.0025mbar真空条件下，1.5h；40℃，0.0025mbar真空条件下，2h。冻干结束后，在氮气环境下封装冻干pcr试剂，制得所述冻干反应试剂。
40、可选地，所述试剂盒还包括：阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为包含各个靶标特定基因序列和rp基因序列的质粒。
41、可选地，所述试剂盒还包括:复溶液，复溶液是用于让阳性对照品和阴性对照品重新溶解的试剂。可选地，阴性对照品为te buffer；复溶液为te buffer。
42、第三方面，本技术还提供一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关病原体的方法，其包括以下步骤：
43、s1、将采集的待测样本进行预处理后加入到pcr反应管中，该pcr反应管中加有如权利要求1所述的引物探针组合物以及其他扩增所需成分，混匀后进行qpcr扩增；反应结束后，采集各通道的荧光信号，得到各通道的熔解曲线的tm值；
44、s2、根据pcr反应体系中的各通道的熔解曲线的tm值判断待测样本中是否含有各病原体。
45、可选地，s2步骤的具体分析判断方法为：
46、当fam通道tm值为73时，代表待测样品中含有产毒性大肠埃希菌；
47、当fam通道tm值为50时，代表待测样品中含有黏附性大肠埃希菌；
48、当fam通道tm值为63时，代表待测样品中含有o1群霍乱弧菌；
49、当fam通道tm值为58时，代表待测样品中含有艰难梭菌；
50、当fam通道tm值为68时，代表待测样品中含有毛霉菌；
51、当fam通道tm值为53时，代表待测样品中含有溶组织内阿米巴；
52、当rox通道tm值为50时，代表待测样品中含有致病性大肠埃希菌；
53、当rox通道tm值为72时，代表待测样品中含有空肠弯曲菌；
54、当rox通道tm值为68时，代表待测样品中含有o139群霍乱弧菌；
55、当rox通道tm值为60时，代表待测样品中含有金黄色葡萄球菌；
56、当rox通道tm值为75时，代表待测样品中含曲霉菌；
57、当rox通道tm值为54时，代表待测样品中含人芽囊原虫；
58、当cy5通道tm值为77时，代表待测样品中含侵袭性大肠埃希菌；
59、当cy5通道tm值为60时，代表待测样品中含鼠伤寒沙门菌；
60、当cy5通道tm值为54时，代表待测样品中含志贺菌；
61、当cy5通道tm值为68时，代表待测样品中含副溶血性弧菌；
62、当cy5通道tm值为72时，代表待测样品中含隐孢子虫；
63、当vic通道tm值为63时，代表待测样品中含出血性大肠埃希菌；
64、当vic通道tm值为74时，代表待测样品中含肠炎沙门菌；
65、当vic通道tm值为58时，代表待测样品中含小肠结肠炎耶尔森菌；
66、当vic通道tm值为49时，代表待测样品中含念珠菌；
67、当vic通道tm值为53时，代表待测样品中含蓝氏贾第鞭毛虫。
68、在上述基础上，进一步可选地，当vic通道tm值为68时，代表待测样品含有内参rnasep基因。
69、所述待测样本为粪便样本，预处理方式为：将待测粪便样本加入到0.9％nacl溶液中。
70、所述荧光扩增仪反应程序为：
71、(1)95℃条件下预变性15s；
72、(2)95℃5秒，60℃10秒，进行40个循环；
73、(3)95℃3分钟；40℃3分钟；
74、(4)熔解程序：45℃-85℃，升温速率0.05℃/s。
75、上述步骤(2)中，60℃时检测荧光；步骤(4)中，45℃-80℃时检测荧光，检测通道：fam、rox、cy5、vic。
76、本发明具有以下有益效果：
77、1、本发明提供的荧光探针组合物可同时进行15种腹泻致病细菌的同步检测，并且在此基础上还可进一步优化后实现22种儿童急性感染性腹泻病相关的细菌、真菌及寄生虫的同步检测。可根据需要对22组引物探针组合物进行组合使用，用法灵活，检测病原体范围广，检测灵敏度高，达到10拷贝/ml，检测效率高。
78、2、通过上述优化的特定的引物探针组合物以及对应的优化的反应体系，即可实现通过不同荧光通道及tm值判断待测样品中的急性感染性腹泻病相关的病原体的种类，在单管体系中实现多种儿童急性感染性腹泻病相关的细菌、真菌及寄生虫的同步检测。此外，待测样本不需要额外处理，试剂可直扩，对于感染性腹泻的临床诊断与用药具有重要的指导意义。
79、3、本发明的试剂盒可采用冻干反应试剂，其稳定性强，便于长期常温储存，无需特定温度条件，并且，使用便利，无需解冻，避免了反复冻融对试剂活性的影响；此外，分装好的冻干反应试剂可直接使用，减少了因液体试剂分装导致的试剂损耗和试剂污染的风险。
80、4、采用本技术的引物探针组合物及试剂盒对待测样本进行儿童急性感染性腹泻病相关的细菌、真菌及寄生虫鉴定，不仅采样便捷，操作步骤简单，检测周期短，成本低，检测结果灵敏度和准确度高。
1.一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关的病原体的引物探针组合物，其特征在于，包括扩增引物对及与所述扩增引物对应的探针，所述引物探针组合物包括至少10组以下分别用于检测各种腹泻致病细菌的引物探针：
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括以下用于检测多种腹泻致病真菌的引物探针：
3.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括以下用于检测多种腹泻致病寄生虫的引物探针：
4.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括用于检测内参rnasep基因的引物探针：如seq id no.67所示的正向引物rp-f，如seq id no.68所示的反向引物rp-r，如seq id no.69所示的荧光探针rp-p。
5.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自fam、rox、cy5和vic中的任一种，所述荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或bhq3。
6.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，荧光探针etec-p、eaec-p、vco1-p、cdiff-p、muc-p和enhs-p5’端标记有fam荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；荧光探针eiec-p、styp-p、sd-p、vp-p和cryp-p的5’端标记有cy5荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq3；荧光探针epec-p、cje-p、vco139-p、sa-p、as-p和bh-p5’端标记有rox荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2；荧光探针ehec-p、se-p、yent-p、ca-p、gial-p和rp-p的5’端标记有vic荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1。
7.一种用于同步检测多种急性感染性腹泻病相关病原体的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～6中任一项所述的引物探针组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括冻干反应试剂，所述冻干反应试剂包括：如权利要求1所述的引物探针组合物、dna聚合酶、反应buffer、dntp、dutp以及冻干保护剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品包含各个靶标基因杂合突变基因型序列和rp基因序列。
10.一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关病原体的方法，为非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，该方法包括以下步骤：
