本发明涉及生物，尤其涉及一种荧光开启型核酸适体信标探针、试剂盒、检测方法及应用。
背景技术：
1、核酸适配体是一种能够与目标物特异性结合的单链dna或rna。与抗体相比，核酸适体具有免疫原性低、生物相容性好，可化学合成，成本低，易于修饰等优点。核酸适体已被应用在化学、生物、医药等领域，受到研究人员的广泛青睐。特别是在分析检测方面，研究人员利用核酸适体作为生物识别元素，开发出了许多检测特定目标物的适体传感器。根据信号转导方式，这些适体传感器可分为比色法、荧光法、电化学法、表面增强拉曼散射法、表面等离子体共振法等类型。其中，荧光适体传感器因为具有灵敏度高、操作方便、响应速度快等优点而备受关注。
2、荧光适体传感器通常是基于荧光共振能量转移(fret)原理构建的，其通过荧光信号的开启或关闭来指示目标物的存在。基于fret的核酸适体传感器主要分为两种类型：(1)dna链取代型和(2)适体信标型。dna链取代型的工作原理如图1a和图1b所示，通常利用荧光基团(fluorophore，f)或淬灭基团(quencher，q)标记的多条dna单链。在没有目标物情况下，各dna单链之间发生杂交反应，导致荧光基团f与淬灭基团q相互靠近，达到fret作用距离，发生荧光淬灭。当目标物存在时，具有适体功能的dna单链会与目标物结合，而不与其它dna单链杂交，导致荧光基团f与淬灭基团q相距较远，超出fret作用距离，体系荧光强度高。这种dna链取代型设计策略不需要知道适体的具体结构特征，适用于任何给定的适体。然而，这种设计策略的实际效果在很大程度上取决于各dna单链之间的杂交反应效率。事实是，由于dna分子间的杂交效率远低于分子内的杂交效率，因此当适体(aptamer)与互补dna(cdna)之间的浓度比(captamer:ccdna)为1:1时，绝大部分(～90％)的适体或cdna处于非杂交状态，导致背景荧光强度很高。为了增加分子间杂交从而降低背景值，通常会使用过量的淬灭基团q标记的dna单链，这会增加试剂成本。此外，目标物在杂交过程中倾向于先与处于游离的适体结合，而不是与处于杂交状态的适体结合。所以，如果淬灭基团q标记的dna单链为适体，且相对于cdna过量，则可能导致这种dna链取代型的适体传感器的灵敏度降低，甚至完全不产生目标物响应信号。相比之下，适体信标设计策略(原理如图1c和图1d所示)仅需要一条dna单链，结构更加简单，效率更高。然而，这种适体信标设计策略的通用性较差。这是因为此策略需要所采用的适体分子具有一个发夹(茎-环)结构，而且目标物-适体结合反应能够导致该发夹(茎-环)结构的打开和关闭，进而发生荧光恢复或荧光淬灭。显然，并非任何适体都拥有这样合适的结构和变化，这完全取决于适体的个体结构特征。
3、在本技术中，我们将核酸适体与短cdna链通过一个polyt连接单元共价偶联到一个dna分子中，制备了一种新型适体信标探针，并成功将其用于目标物黄曲霉毒素b1的高效率检测。
技术实现思路
1、本发明提供了一种荧光开启型核酸适体信标探针、试剂盒、检测方法及应用，制得的新型核酸适体信标探针用于黄曲霉毒素b1的检测，灵敏度及特异性高，解决了现有技术中存在的问题。
2、本发明所采用的技术方案之一是：
3、提供了一种荧光开启型核酸适体信标探针，包括核酸适体、短cdna、polyt连接臂、荧光基团和淬灭基团；polyt连接臂连接于核酸适体3’端和短cdna的5’端，在核酸适体5’端和短cdna的3’端分别标记淬灭基团和荧光基团或者在核酸适体5’端和短cdna的3’端分别标记荧光基团和淬灭基团；短cdna的3’端序列与所述核酸适体的5’端序列互补以使淬灭基团和荧光基团相邻近；
4、所述适体序列是一段对黄曲霉毒素b1具有特异性识别能力的dna，其核苷酸序列如seq id no1所示；所述短cdna序列如seq id no2所示；所述polyt连接臂由48-72个胸腺嘧啶脱氧核苷酸聚合而成。
5、进一步地，所述polyt连接臂由48个胸腺嘧啶脱氧核苷酸聚合而成，其核苷酸序列如seq id no3所示。
6、seq id no1：5’-bhq1-acgtgttgtctctctgtgtctcgt-3’；
7、seq id no2：5’-aacacgt-fam-3’；
8、seq id no3：5’
9、tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt-3’。
10、以上seq id no1、seq id no2序列中bhq1、fam分别为在端部修饰的荧光淬灭剂和荧光基团。(序列表中的各序列中省去了端部荧光基团或淬灭基团。)
11、进一步地，所述荧光开启型核酸适体信标探针的全序列如以下seq id no4所示：
12、【5’-bhq1-acgtgttgtctctctgtgtctcgt
13、ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttaacacgt-fam-3’】。
14、进一步地，所述淬灭基团为黑洞猝灭剂ⅰ(black hole quencherⅰ，bhq1)，所述荧光基团为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，fam)。
15、本发明所采用的技术方案之二是：
16、提供了检测黄曲霉毒素b1的试剂盒，包括如上所述的荧光开启型核酸适体信标探针。
17、本发明还提供了一种检测黄曲霉毒素b1的传感器体系，包括如上所述的荧光开启型核酸适体信标探针或试剂盒；在传感器体系中，核酸适体信标探针的浓度为20nmol/l。
18、进一步地，上述传感器体系还包括缓冲溶液，缓冲溶液为ph 8.0的buffer-a，其中，含20mmol/l磷酸盐、150mmol/l nacl和20mmol/l mgcl2和0.01％(v/v)吐温20。
19、本发明所采用的技术方案之三是：
20、提供了一种检测黄曲霉毒素b1的方法，包括利用如上所述的荧光开启型核酸适体信标探针检测黄曲霉毒素b1的步骤。
21、进一步地，上述方法包括如下操作步骤：
22、s1将荧光开启型核酸适体信标探针及一定浓度待测样品混合于相应的缓冲溶液中，室温孵育，得混合孵育溶液；
23、s2测定混合孵育溶液的荧光强度，若荧光强度上升，说明待测样品中含有黄曲霉毒素b1。
24、进一步地，s1中室温孵育3min；缓冲溶液为ph 8.0的buffer-a；s2中激发/发射波长为485/525nm。
25、本发明所采用的技术方案之四是：
26、提供了如上所述的探针或试剂盒在检测黄曲霉毒素b1中的应用。
27、本发明的有益效果：
28、本发明的荧光开启型适体信标探针的工作原理是基于dna分子内杂交/解离反应，而非dna分子间的反应，因此效率更高，所需cdna更短。新制备的核酸适体信标探针具有结构简单、背景低、信号变化幅度大、响应迅速、操作简便等优点。
29、本发明荧光开启型核酸适体信标探针的polyt连接臂(linker)用于连接核酸适体(aptamer)的3’端和短cdna的5’端，以形成一个dna分子整体。荧光基团f被标记于cdna序列的3’端，淬灭基团q被标记在核酸适体(aptamer)序列的5’端。无目标物分子时，短cdna将与核酸适体杂交，使得荧光基团f和淬灭基团q相邻近，发生荧光淬灭现象，荧光强度低。加入目标物后，核酸适体更倾向于与目标物结合，使得cdna解离，淬灭基团q远离荧光基团f，荧光恢复。用于黄曲霉毒素b1浓度的检测，通过荧光强度的测定，实现了快速、高特异性检测。
1.一种荧光开启型核酸适体信标探针，其特征在于，包括核酸适体、短cdna、polyt连接臂、荧光基团和淬灭基团；polyt连接臂连接于核酸适体3，端和短cdna的5，端，在核酸适体5，端和短cdna的3，端分别标记淬灭基团和荧光基团或者在核酸适体5，端和短cdna的3，端分别标记荧光基团和淬灭基团；短cdna的3，端序列与所述核酸适体的5，端序列互补以使淬灭基团和荧光基团相邻近；
2.根据权利要求1所述的荧光开启型核酸适体信标探针，其特征在于，所述polyt连接臂由48个胸腺嘧啶脱氧核苷酸聚合而成，其核苷酸序列如seq id no3所示。
3.根据权利要求1所述的荧光开启型核酸适体信标探针，其特征在于，所述荧光开启型核酸适体信标探针的全序列如以下seq id no4所示：
4.根据权利要求1所述的荧光开启型核酸适体信标探针，其特征在于，所述淬灭基团为黑洞猝灭剂ⅰ，所述荧光基团为6-羧基荧光素。
5.检测黄曲霉毒素b1的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5中任一所述的荧光开启型核酸适体信标探针。
6.一种检测黄曲霉毒素b1的方法，其特征在于，包括利用权利要求1-5中任一所述的荧光开启型核酸适体信标探针检测黄曲霉毒素b1的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，s1中室温孵育3min；缓冲溶液为ph 8.0的buffer-a；s2中激发/发射波长为485/525nm。
9.如权利要求1-4任一所述的探针或如权利要求5所述的试剂盒在检测黄曲霉毒素b1中的应用。
