本发明属于分子生物学检测，尤其涉及一种用于副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型检测的引物探针组、试剂盒及其应用。
背景技术：
1、副猪嗜血杆菌属于革兰氏阴性短杆菌，主要定植于猪上呼吸道，当猪抵抗力下降时会引起猪的以多发性纤维素性浆膜炎和关节炎为特征的细菌性传染病，称为副猪嗜血杆菌病，也称为格拉瑟氏病。目前，已经鉴定出15种副猪嗜血杆菌血清型，还存在许多无法分型的菌株，其中，1型、5型、10型、12型、13型和14型为高毒力型，其余血清型为弱毒型或无毒型。近年来，5型、7型、11型的感染率越来越高，但是传统的检测方法一般仅能实现单一血清型的检测，存在检测效率较低的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型检测的引物探针组、试剂盒及其应用，本发明的引物探针组能够实现副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型的多重检测，检测效率高。
2、本发明提供了一种用于副猪嗜血杆菌5型、7型和11型三种血清型taqman多重荧光定量pcr检测的引物探针组，包括第一引物探针组、第二引物探针组和第三引物探针组；所述第一引物探针组包括上游引物wcwk-f、下游引物wcwk-r和探针wcwk-p；所述上游引物wcwk-f、下游引物wcwk-r和探针wcwk-p的核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示；所述第二引物探针组包括上游引物funq-f、下游引物funq-r和探针funq-p；所述上游引物funq-f、下游引物funq-r和探针funq-p的核苷酸序列分别如seq idno.4、seq id no.5和seq id no.6所示；所述第三引物探针组包括上游引物amta-f、下游引物amta-r和探针amta-p；所述上游引物amta-f、下游引物amta-r和探针amta-p的核苷酸序列分别如seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9所示；所述探针wcwk-p、探针funq-p和探针amta-p的5'端分别修饰有不同颜色的荧光基团。
3、优选的，所述探针wcwk-p的5'端修饰有荧光基团fam；所述探针funq-p的5'端修饰有荧光基团hex；所述探针amta-p的5'端修饰有荧光基团cy5；所述探针wcwk-p和探针funq-p的3'端分别修饰有淬灭基团bhq1；所述探针amta-p的3'端修饰有淬灭基团bhq2。
4、本发明还提供了上述方案所述的引物探针组在制备副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型检测的产品中的应用。
5、本发明还提供了一种用于副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型检测的试剂，包括上述方案所述的引物探针组和引物组；所述引物组包括第一引物组、第二引物组和第三引物组；所述第一引物组包括上游引物wcwk-f1和下游引物wcwk-r1；所述上游引物wcwk-f1和下游引物wcwk-r1的核苷酸序列分别如seq id no.10和seq id no.11所示；所述第二引物组包括上游引物funq-f1和下游引物funq-r1；所述上游引物funq-f1和下游引物funq-r1的核苷酸序列分别如seq id no.12和seq id no.13所示；所述第三引物组包括上游引物amta-f1和下游引物amta-r1；所述上游引物amta-f1和下游引物amta-r1的核苷酸序列分别如seq id no.14和seq id no.15所示。
6、本发明还提供了一种用于副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型检测的试剂盒，包括上述方案所述的引物探针组。
7、优选的，所述试剂盒还包括质粒标准品；所述质粒标准品包括第一重组质粒、第二重组质粒和第三重组质粒；所述第一重组质粒、第二重组质粒和第三重组质粒分别以pmd18为骨架质粒；所述第一重组质粒上插入有由第一引物组扩增得到的wcwk基因；所述第二重组质粒上插入有由第二引物组扩增得到的funq基因；所述第三重组质粒上插入有由第三引物组扩增得到的amta基因；所述第一引物组包括上游引物wcwk-f1和下游引物wcwk-r1；所述上游引物wcwk-f1和下游引物wcwk-r1的核苷酸序列分别如seq id no.10和seq idno.11所示；所述第二引物组包括上游引物funq-f1和下游引物funq-r1；所述上游引物funq-f1和下游引物funq-r1的核苷酸序列分别如seq id no.12和seq id no.13所示；所述第三引物组包括上游引物amta-f1和下游引物amta-r1；所述上游引物amta-f1和下游引物amta-r1的核苷酸序列分别如seq id no.14和seq id no.15所示。
8、优选的，所述试剂盒还包括taqdna聚合酶、passive reference dye和无核酸酶水。
9、本发明还提供了一种非诊断目的的副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型的taqman多重荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：提取待测样品的基因组dna；以所述待测样品的基因组dna为模板，采用上述方案所述的引物探针组进行taqman多重荧光定量pcr，根据有无扩增荧光信号判定待测样品是否含有副猪嗜血杆菌5型、7型和11型。
10、优选的，所述taqman多重荧光定量pcr的反应体系以20μl计，包括以下组分：taqdna聚合酶10μl、上游引物wcwk-f 0.4μl、上游引物funq-f 0.4μl、上游引物amta-f 0.4μl、下游引物wcwk-r 0.4μl、下游引物funq-r 0.4μl、下游引物amta-r 0.4μl、模板3μl、探针wcwk-p 0.4μl、探针funq-p 0.4μl、探针amta-p 0.4μl、passive reference dye 0.4μl和无核酸酶水3.0μl。
11、优选的，所述taqman多重荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。
12、本发明提供了一种用于副猪嗜血杆菌5型、7型和11型三种血清型taqman多重荧光定量pcr检测的引物探针组，包括第一引物探针组、第二引物探针组和第三引物探针组；所述第一引物探针组包括上游引物wcwk-f、下游引物wcwk-r和探针wcwk-p；所述第二引物探针组包括上游引物funq-f、下游引物funq-r和探针funq-p；所述第三引物探针组包括上游引物amta-f、下游引物amta-r和探针amta-p；所述探针wcwk-p、探针funq-p和探针amta-p的5'端分别修饰有不同颜色的荧光基团。本发明的引物探针组能够通过多重荧光定量pcr同时鉴别三种血清型，检测效率高，且对其他常见病原菌无交叉反应。
13、本发明还提供了一种用于副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型检测的试剂，包括上述方案所述的引物探针组和引物组；所述引物组包括第一引物组、第二引物组和第三引物组。本发明的引物组能够用于构建副猪嗜血杆菌5型、7型和11型三种血清型特异性基因的质粒标准品。本发明的试剂为临床上副猪嗜血杆菌优势血清型的检测提供了有力的技术手段，也为疾病的预防和控制奠定了一定的技术基础。
1.一种用于副猪嗜血杆菌5型、7型和11型三种血清型taqman多重荧光定量pcr检测的引物探针组，其特征在于，包括第一引物探针组、第二引物探针组和第三引物探针组；
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针wcwk-p的5'端修饰有荧光基团fam；所述探针funq-p的5'端修饰有荧光基团hex；所述探针amta-p的5'端修饰有荧光基团cy5；所述探针wcwk-p和探针funq-p的3'端分别修饰有淬灭基团bhq1；所述探针amta-p的3'端修饰有淬灭基团bhq2。
3.权利要求1或2所述的引物探针组在制备副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型检测的产品中的应用。
4.一种用于副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型检测的试剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组和引物组；所述引物组包括第一引物组、第二引物组和第三引物组；所述第一引物组包括上游引物wcwk-f1和下游引物wcwk-r1；所述上游引物wcwk-f1和下游引物wcwk-r1的核苷酸序列分别如seq id no.10和seq id no.11所示；所述第二引物组包括上游引物funq-f1和下游引物funq-r1；所述上游引物funq-f1和下游引物funq-r1的核苷酸序列分别如seq id no.12和seq id no.13所示；所述第三引物组包括上游引物amta-f1和下游引物amta-r1；所述上游引物amta-f1和下游引物amta-r1的核苷酸序列分别如seqid no.14和seq id no.15所示。
5.一种用于副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质粒标准品；所述质粒标准品包括第一重组质粒、第二重组质粒和第三重组质粒；所述第一重组质粒、第二重组质粒和第三重组质粒分别以pmd18为骨架质粒；
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括taq dna聚合酶、passive reference dye和无核酸酶水。
8.一种非诊断目的的副猪嗜血杆菌5型、7型和11型血清型的taqman多重荧光定量pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的多重荧光定量pcr检测方法，其特征在于，所述taqman多重荧光定量pcr的反应体系以20μl计，包括以下组分：taq dna聚合酶10μl、上游引物wcwk-f 0.4μl、上游引物funq-f 0.4μl、上游引物amta-f0.4μl、下游引物wcwk-r 0.4μl、下游引物funq-r 0.4μl、下游引物amta-r 0.4μl、模板3μl、探针wcwk-p 0.4μl、探针funq-p 0.4μl、探针amta-p 0.4μl、passive reference dye 0.4μl和无核酸酶水3.0μl。
10.根据权利要求8所述的多重荧光定量pcr检测方法，其特征在于，所述taqman多重荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。
