一种防治根螨的菌药组合物及应用的制作方法

1.本发明属于昆虫防治技术领域，具体涉及一种防治根螨的菌药组合物及应用。


背景技术：

2.苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌(bacillus thuringiensis，简称bt)是一种革兰氏阳性细菌，因其环境友好、对人畜无害、不污染环境、对目标害虫高效专一，因而bt在害虫的生物防治中得到了规模化生产的应用，是目前应用最广泛的微生物杀虫剂。
3.根螨是近年来农业上新兴的重要害虫，目前已知种类约31种以上，是世界上重要的球根作物害虫，其寄主广泛，包含许多重要球根、球茎、根茎、块茎及鳞茎类的蔬菜、花卉作物，例如石蒜科、百合科、鸢尾科、茄科及十字花科等作物。在分类地位上根螨指粉螨科，包括根螨属(rhizoglyphus)、嗜木螨属(caloglyphus)及士维螨属(schwiebea)等，因其以植物的根部和地下组织为食而泛称为根螨，在中国台湾已纪录的根螨种类有罗宾根螨(r. robini)、刺足根螨(r.echinopus)、长毛根螨(r.setosus)、紫草根螨(r. callae)、水芋根螨(r.caladii)、台湾根螨(schwiebea taiwanesis)、全毛根螨(schwiebea cuucta)等。
4.根螨个体微小，但繁殖能力强，发育适温在20℃～25℃，适宜湿度为 94％100％，在适宜条件下完成一代繁殖需10天～17天。以成螨、若螨在土壤内或被害植株内越冬，在土壤中为害球根、球茎、鳞茎及块茎类植物地下部分的重要害虫。近些年来，根螨在大蒜、韭菜、藠头、洋葱、生姜、马铃薯、半夏、百合、贝母等作物上出现过大面积发生，危害严重，影响植株吸收营养及水分，植株长势弱，叶片枯黄。根螨既有寄生性也有腐生性，能携带微生物病菌，其休眠体常附着在节肢动物，如苍蝇、甲虫等身体上传播，加重根腐病、腐烂病、疫病等病害发生，严重影响作物的产量和品质。同时引起发生隐蔽，因此防治非常困难。生产上，长期使用化学农药，不仅易引起昆虫抗性增强，而且长期施用，造成环境污染，降低农产品品质和安全等问题尤为突出。虽然目前已经筛选到苏云金芽胞杆菌(bacillus thuringiensis) jqd117具有防治根螨的效果，但是单一使用生物农药，仍存在的速效性差、持效性期短等弊端。截止2022年2月，中国农药登记网站上，还未见登记在中草药上防治根螨的药剂。药剂的短缺也是目前中草药生产中亟需解决的生产难题。


技术实现要素：

5.本发明所述菌药复配组合物不仅可以提高对根螨的防治效果，减少化学药剂施用量，保护生态环境，降低农产品食品安全隐患；而且还可以延长持效期，提高作物产量和品质，有效弥补生物杀虫剂杀虫速效性差，及单一药剂选择压力下易产生抗药性的弊端；本发明不仅筛选到对根螨具有较高防治效果的单剂，而且进一步获得最佳的菌药组合，不仅解决了生产难题，而且为企业在防治根螨的药剂开发上提供了思路。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种防治根螨的菌药组合物，所述菌药组合物包括苏云金芽胞杆菌菌剂和呋虫胺，所述菌剂和呋虫胺的体积比为10～50:50～80。
8.优选的，所述菌剂中苏云金芽胞杆菌的活菌数不低于1
×
108cfu/ml。
9.优选的，所述苏云金芽胞杆菌包括苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)jqd117，保藏编号为cgmcc no.9763。
10.优选的，所述苏云金芽胞杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：将活化的苏云金芽胞杆菌菌种接种到lb液体培养基中，摇床培养10h～14h，得种子液；
11.将所述种子液接种到黄豆饼淀粉培养基上，摇床培养至发酵液中胞晶分离达到95％，得发酵液；
12.调节所述发酵液的ph值至4.0～4.5，与苯甲酸钠混合，得所述菌剂；所述苯甲酸钠的质量为所述发酵液质量的0.3％～0.4％。
13.优选的，所述摇床培养的温度为30℃，震荡频率为180rpm～220rpm。
14.优选的，所述种子液的接种体积为所述黄豆饼淀粉培养基体积的 2％～4％。
15.优选的，所述黄豆饼淀粉培养基包括以下质量百分含量的组分：棉籽饼粉3.00％，大豆饼粉1.50％，酵母粉1.00％，可溶性淀粉1.50％，caco
3 0.40％，mnso40.03％，mgso40.20％，k2hpo40.05％和余量的水。
16.优选的，jqd117菌株的最佳发酵条件为：接种量2％～4％，培养温度29℃～31℃，转速180～220rpm，初始ph7.0～7.5。
17.本发明还提供了上述菌药组合物在防治根螨中的应用。
18.本发明还提供了一种防治根螨的方法，向土壤中施加上述菌药组合物。
19.优选的，所述菌药组合物的施加量为1.75kg/亩～2.0kg/亩。
20.有益效果：本发明提供了一种防治根螨的菌药组合物，将苏云金芽胞杆菌(bt)的菌剂和呋虫胺按照10～50:50～80的体积比进行复配，毒效比率大于1.25，表现为增效作用。本发明所述菌药复配或混合使用技术不仅可以减少化学药剂施用量，延缓根螨对化学杀虫剂抗药性的产生和发展，还可以弥补生物杀虫剂杀虫速效性差的弊端，将bt与呋虫胺在一定浓度下复配，可以达到最佳的增效效果。本发明所述菌药组合物对根螨的防治具有重要的田间指导意义。
附图说明
21.图1为不同处理对半夏刺足根螨防治效果对比图，其中左为呋虫胺防治区，右为bt 呋虫胺防治区。
具体实施方式
22.本发明提供了一种防治根螨的菌药组合物，所述菌药组合物包括苏云金芽胞杆菌菌剂和呋虫胺，所述菌剂和呋虫胺的体积比为10～50:50～80。
23.本发明所述苏云金芽胞杆菌优选包括苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)jqd117，保藏编号为cgmcc no.9763，已在中国专利 cn110720470a中进行公开(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年10月14日，具体保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。本发明所述菌剂中苏云金芽胞杆菌的活菌数优选不低于1
×
108cfu/ml，更优选不低于5.0
×ꢀ
108cfu/ml。
24.本发明所述苏云金芽胞杆菌菌剂的制备方法，优选包括以下步骤：将活化的苏云金芽胞杆菌菌种接种到lb液体培养基中，摇床培养10h～14h，得种子液；
25.将所述种子液接种到黄豆饼淀粉培养基上，摇床培养至发酵液中胞晶分离达到95％，得发酵液；
26.调节所述发酵液的ph值至4.0～4.5，与苯甲酸钠混合，得所述菌剂；所述苯甲酸钠的质量为所述发酵液质量的0.3％～0.4％。
27.本发明优选对保藏的苏云金芽胞杆菌进行活化，所述活化优选包括将保存的bt菌株jqd117在lb平板培养基上活化，挑取单菌落在lb斜面培养基上30℃培养4天，得活化的菌株。本发明将所述活化的菌株单菌落接种到 lb液体培养基中，摇床培养10h～14h，得种子液，所述所述摇床培养的温度优选为30℃，震荡频率优选为180rpm～220rpm。本发明将所述种子液接种到黄豆饼淀粉培养基上继续摇床培养，所述种子液的接种体积优选为所述黄豆饼淀粉培养基体积的2％～4％。
28.本发明所述黄豆饼淀粉培养基优选包括以下重量百分含量的组分：
29.棉籽饼粉3.00％，大豆饼粉1.50％，酵母粉1.00％，可溶性淀粉 1.50％，caco30.40％，mnso40.03％，mgso40.20％，k2hpo40.05％和余量的水；且在所述黄豆饼淀粉培养基上的最佳发酵条件为：接种量2％～4％，温度29℃～31℃，转速180rpm～220rpm，初始ph 7.0～7.5。本发明将得到的发酵液调节ph值至4.0～4.5，添加质量比0.3％～0.4％的苯甲酸钠，即得所述菌剂。
30.本发明将所述菌剂与呋虫胺进行复配，当bt菌剂与呋虫胺以 10～50:50～80的体积比复配时，毒效比率大于1.25，表现为增效作用。
31.本发明还提供了上述菌药组合物在防治根螨中的应用。
32.本发明通过室内生物活性测定，表明所述菌药组合物对根螨具有生物防治效果，并且对根螨的杀虫效果较好。
33.本发明还提供了一种防治根螨的方法，向土壤中施加上述菌药组合物。
34.本发明所述菌药组合物在施加时，优选随水冲施，且施加量优选为1.75 kg/亩～2.0kg/亩。
35.下面结合实施例对本发明提供的一种防治根螨的菌药组合物及应用和防治方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
36.实施例1
37.一、bt母药制备
38.通过对jqd117菌株发酵培养基和发酵条件进行优化，提高了苏云金芽胞杆菌的芽胞产量。
39.(1)菌种活化：将保存的bt菌株jqd117在lb平板培养基(其组成成分及其比例为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，水1l，ph7.2。)上活化，挑取单菌落在lb斜面培养基上30℃培养4天，得活化的菌株。
40.(2)种子液的制备：用无菌接种环刮取一小环步骤(1)活化的菌株接种到lb液体培养基(其组成成分及其比例为：胰蛋白胨10g，酵母提取物 5g，氯化钠10g，水1l，ph7.2)50ml中，在30℃、摇床转速为220rpm的条件下培养10～14h，得种子液。
41.(3)发酵培养：按照体积比为1％的比例将步骤(2)的种子液接入到黄豆饼淀粉粉
培养基(其组成成分及其重量百分比为：最佳发酵培养基为棉籽饼粉3.00％，大豆饼粉1.50％，酵母粉1.00％，可溶性淀粉1.50％，caco
3 0.40％，mnso40.03％，mgso40.20％，k2hpo40.05％)加水混合溶解，初始ph 7.5，121℃灭菌30min，再降到30℃备用；最佳发酵条件为：接种量 2％～4％，温度29℃～31℃，转速180rpm～220rpm。
42.在温度30℃，转速180rpm摇床培养36h，检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中胞晶分离达到95％时停止发酵培养，得发酵液；经稀释平板计数法计数发酵液中的活菌数大于7.5
×
109cfu/ml(每毫升溶液中含有的活芽胞个数)，较之前的发酵水平提高了37.61％，同时发酵时间由48小时降到了36小时，节省了25％。
43.(4)步骤(3)所得发酵液调节ph值至4.0～4.5，添加0.3％～0.4％的苯甲酸钠，即得bt菌剂母药。
44.二、单独bt菌剂和常用化学药剂毒力测定
45.(一)将bt菌剂稀释至1
×
109cfu/ml、1
×
108cfu/ml、1
×
107cfu/ml、 1
×
106cfu/ml和1
×
105cfu/ml，共5个浓度梯度。设苏云金芽胞杆菌jq23 菌株作为bt对照菌株，浓度同上。
46.化学杀虫剂对照选择：20％呋虫胺可溶粒剂和1.8％阿维菌素乳油。
47.空白对照：无菌水。
48.(二)试验方法：
49.(1)将灭菌的1.5％水琼脂倒入一次性塑料培养皿中，厚度为3mm，上铺两层滤纸；
50.(2)将半夏球茎切成2～3mm的片状，浸泡在(一)制备的不同浓度药液中分别浸泡1min后，取出放入保湿平皿中。
51.(3)挑取大小一致、健康活泼的根螨若虫接种在步骤(2)中含药的半夏切片上，以无菌水作为对照。置于25℃、光周期14h：10h(l：d)条件下饲养。每处理30头根螨，设3次重复，施药后定期调查死亡虫数，计算校正死亡率。
52.(三)试验结果：
53.通过室内生物活性测定，结果表明，试验用苏云金芽胞杆菌jqd117菌株(保藏编号为cgmcc no.9763)和jq23菌株(cn104099277a中公开) 均为对韭蛆高毒力菌株，但根螨生测试验结果显示：jqd117菌株对根螨表现较高毒力，lc
50
为6.47
×
106cfu/ml，jq23菌株对根螨无杀虫活性，可见不同的bt菌株杀虫谱不尽相同。
54.同时，单独测定两种化学杀虫剂呋虫胺和阿维菌素对根螨杀虫活性，结果显示，呋虫胺对根螨的lc
50
为2.83mg/l，阿维菌素对根螨的lc
50
为 3.21mg/l，两种化学杀虫剂对根螨均有较好的杀虫活性。
55.实施例2
56.bt菌剂与不同化学杀虫剂最佳配比筛选
57.以实施例1得到的单剂bt和各化学杀虫剂的lc
50
值为基础，以各自 lc
50
值为100％，然后10等分，分别计算在各比例中的含量，设11个浓度梯度及空白对照共12个处理进行测定。计算预期死亡率和毒效比率。
58.试验方法：
59.采用交互测定法进行最佳配比的筛选。以单剂a、b的lc
50
值为基础，设11个浓度梯度及空白对照共12个处理进行测定，其中各处理两单剂比例见表1(以各自lc
50
值为100％，
然后10等分，分别计算在各比例中的含量)。
60.表1各处理单剂比例(％)
[0061][0062]
利用实施例1相同的生测方法进行统计。
[0063]
各处理测定结果计算公式如下：
[0064]
预期死亡率＝a药剂lc
50
值实测死亡率
×
a药剂所占比例 b药剂lc
50
值实测死亡率
×
b药剂所占比例；
[0065]
毒效比率＝实际死亡率/预期死亡率。
[0066]
其中a，b农药lc
50
值实际死亡率及混用的实际死亡率都以测定校正死亡率来计算。毒效比率》1.25表现增效作用，毒效比率《0.75表现拮抗作用，毒效比率在1左右为相加作用。
[0067]
结果如表2和表3所示，当jqd117与呋虫胺以一定比例10～50:50～80 复配时，毒效比率大于1.25，表现为增效作用，其他比例混配时，还可表现出拮抗或相加作用(表2)；与阿维菌素复配各配比毒效比率在0.10和0.66 之间，均表现为拮抗作用(表3)。jq23与呋虫胺以任何比例混用，均表现为相加作用(表4)；jq23与阿维菌素，以任何比例混用，均表现为拮抗或相加作用(表5)。
[0068]
可见，jqd117与呋虫胺以一定剂量配比时，会表现为增效作用，但并不是与所有化学药剂混用都有增效作用，而且混配的比例不同，作用也会不同(表2，表3)。同时，不同的bt菌株与不同的化学药剂混用，表现出的作用也有不同。
[0069]
表2 jqd117与呋虫胺最佳配比初步筛选
[0070][0071][0072]
表3 jqd117与阿维菌素最佳配比初步筛选
[0073][0074]
表4 jq23与呋虫胺最佳配比初步筛选
[0075][0076]
表5 jqd117与阿维菌素最佳配比初步筛选
[0077][0078][0079]
实施例3
[0080]
半夏根螨田间防治效果比较
[0081]
2021年7月5日，在安国中草药生产区调查发现半夏受刺足根螨 rhizoglyhus echinopus为害严重地块，整畦顺垅危害，严重地块出苗率减少 70％，造成半夏生长点不能
发芽。
[0082]
7月6日，采用50亿/ml bt(jqd117)悬浮剂3kg/亩，20％呋虫胺可溶粒剂(中农立华生物科技股份有限公司)0.5kg/亩，(50亿/ml bt(jqd117) 悬浮剂1.5kg 20％呋虫胺可溶粒剂250g)/亩，和1.8％阿维菌素乳油(河北威远生物化工有限公司)1kg/亩，设清水空白对照，共5个处理区，每处理区面积相同，均为1亩地(667m2)，重复三次，均采用随水冲施方法，施于受害的半夏田块中，施药后分别于药后7天、14天、28天和采收期进行调查，并计算防治效果。试验期间不使用其他技术进行根螨防治，正常的田间水肥等农事管理均保持一致。
[0083]
结果如表6所示，药后7天、14天和28天，bt 呋虫胺组合对半夏的保苗率均达到90％以上，对根螨的防治效果均达到95％以上，均高于其他处理组防治效果。
[0084]
单独的bt、呋虫胺、阿维菌素单次施药，在第28天时，防治效果明显下降，bt与呋虫胺混用，其持效期在28天时，防治效果基本无变化，持效期显著高于其他处理。
[0085]
结果显示，bt与呋虫胺混用，不仅提高了对根螨防治效果，延长了药效，同时减少化学农药使用量50％，产量较单独使用bt、呋虫胺、阿维菌素分别提高了29.91％，32.64％和54.63％。
[0086]
bt与呋虫胺混合施用，不仅提高了对韭蛆高龄幼虫的防治效果，延长了药效持效期，而且减少了化学农药使用量，降低了农药残留风险和安全隐患，提高了食品质量和品质，具有良好的推广应用前景。
[0087]
表6不同处理对半夏根螨田间防治效果
[0088][0089][0090]
注：不同字母代表纵向比较不同药剂防效和产量差异。
[0091]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。