本发明属于生物医药领域，具体涉及一种结核分枝杆菌全基因组捕获方法、引物组及试剂盒。
背景技术：
1、结核分枝杆菌(mycobacterium tubercμlosis,mtb)是结核病(tubercμlosis)的病原体。结核病是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，它严重危害人类的健康和社会发展。当前结核病防治工作面临巨大挑战。对结核分枝杆菌感染的准确诊断在结核病防治起着关键作用。如果直接针对原始临床样本进行通常全基因组测序(whole genomesequencing,wgs)，在24h～48h即可提供精确序列，对判断细菌基因突变位点准确、及时，还可发现新的突变位点，以及应用于流行病学、mtb耐药机制研究。尽管mtb的耐药机制尚不完全明确，也没有一个完整的数据库用于基因组测序后的药敏检测和表型预测，但全基因组测序工作可整合到常规诊断工作流程，以逐步取代早期诊断检测中药敏表型检测技术。
2、全基因组测序(wholegenomesequencing,wgs)作为一种常用的基因分型技术具有高分辨率特点，不仅能够识别基因组上的单核苷酸多态性(snp)确定mtb在传播过程中的微进化，还可以获得目的基因组上的全部序列，预测大多数抗结核药物的耐药性。ngs在mtb耐药性检测中应用：ngs由于其具有简便、快速、准确和可靠等优点，被临床广泛应用在mtb耐药性检测中，特别是对检测多重耐药的结核病人，是有效治疗耐药结核分枝杆菌的关键。
3、通过全基因组测序技术获得mtb全基因序列，利用已知的mtb耐药机制，在全基因水平上检测相关耐药突变，使基于分子生物学的耐药检测不再局限于一种或几种一线药物。全基因组测序技术往往被用在耐药的科学研究方面，用于发现新的耐药位点和解释新的耐药机制。
4、因此获得mtb全基因组的意义非常重大。
技术实现思路
1、为弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌全基因组捕获方法、引物组及试剂盒。
2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明第一方面提供一种用于结核分枝杆菌全基因组扩增的引物组合。
4、进一步，所述引物组合包括针对结核分枝杆菌细胞基因组设计的20条引物，所述20条引物具有ttcgtcga、cgataccg、cgatcgtc、cttcgtcg、cgaagtcg、cgaatccg、cgaactcg、cgattccg、cgatcagc、gttgaccg、gttgtcgg、gtcgtcg、atcgtcg、tcgtcgg、cgaaccg、gcgaacg、cgtaccg、cgtagcg、cgtcgta、tatcgcg所示的序列。
5、在本发明中，引物组合与引物可以互换使用，引物是指短的核酸分子，本发明公开的引物长度在7到8个核苷酸之间。可以通过核酸杂交与互补的靶核酸分子退火，在引物和靶核酸链之间形成杂交体。引物可以通过聚合酶沿着靶核酸分子延伸。因此，引物可用于扩增靶核酸分子，其中引物的序列对于靶核酸分子是特异性的。
6、靶核酸分子是指打算对其进行检测、定量、定性检测或其组合的核酸分子。核酸分子不是必须处于纯化的形式。各种不同的其它核酸分子也可以与靶核酸分子共存。例如，靶核酸分子可以是意在对其进行扩增的特异性核酸分子。如果需要，靶核酸分子的纯化或分离可以通过本领域技术人员已知的方法来进行，例如使用可商购的纯化试剂盒等。
7、在一些实施方案中，与本发明所述的引物和/或探针序列具有70％以上同源性的序列对应的引物和/或探针也均包含在本发明的保护范围内，也即可以理解为：在本发明提供的引物和/或探针的基础上进行改变之后得到的引物和/或探针同样落入本发明的保护范围。
8、本发明第二方面提供一种试剂盒。
9、进一步，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物组合。
10、进一步，所述试剂盒还包括pcr扩增缓冲液、扩增酶、dtt、dntp、焦磷酸酶、无核酸酶纯水。
11、进一步，所述扩增酶包括dna聚合酶和/或rna聚合酶。
12、优选地，所述扩增酶为dna聚合酶。
13、进一步，所述试剂盒还包括说明书。
14、在本发明中，适合量的一种或多种引物被提供在一个或多个容器中，或固定在基质上，引物可以被提供成悬浮在水溶液中，或例如作为冷冻干燥的或冻干的粉末。其中，提供有核酸的容器可以是任何能够容纳所提供的形式的常规容器，例如微量离心管、安瓿瓶或瓶。试剂盒可以包含标记的或未标记的、用于检测结核分枝杆菌序列的探针。
15、在某些应用中，一个或多个引物(如上所述)，可以预先测量好的单次使用量提供在独立的、典型情况下用后即可抛弃的管或相当的容器中。使用这样的设置，用于测试消化道病毒的存在的样品，可以加入到独立的管中，直接进行扩增。
16、试剂盒中提供的核酸引物的量，可以是任何适合的量，可以依赖于产品所针对的靶市场。例如，如果试剂盒适用于研究或临床应用，提供的每种核酸引物的量，可以是足够引发几个pcr扩增反应的量。确定适合的量的一般性指导，可以在innis等、sambrook等和ausubel等的文献中发现。试剂盒可以包含两个以上的引物，以便于较大量结核分枝杆菌核苷酸序列的pcr扩增。
17、在某些实施方案中，试剂盒可以含有执行pcr扩增反应所必需的反应试剂，包括dna样品制备试剂、用于pcr的酶、缓冲液、mg2+和脱氧核糖核苷酸(dntps)。
18、其中，pcr的酶包括dna聚合酶和/或rna聚合酶。
19、所述dna聚合酶包括但不限于taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4 dna聚合酶、klenow片段。
20、dntp是为了进行基于pcr的dna扩增的核苷源，datp、dgtp、dctp、dttp这4种是必要的。另外，关于dntp，可使用为了用于热启动法而进行了化学修饰的物质，例如可使用trilink biotechnologies，inc.制cleanamptmdntp。
21、在基于pcr的dna扩增中，mg2+是必要的。作为mg2+源，包括但不限于mgcl2、mgso4等。
22、在本发明中，所述试剂盒还包括说明书，说明书可以包括关于获得样品、处理样品的指导。
23、此外，试剂盒中可包含作为pcr的阳性对照而使用的细菌的基因组dna、作为阴性对照而使用的无菌水。
24、实施本发明时，作为另外的必要的器具，可举出移液器、移液器用枪头、1.5ml微型管(microtube)等在分子生物学的实验中广泛使用的器具类，作为装置类，可举出pcr、净化台、管用离心机等在分子生物学的实验中广泛使用的仪器。
25、本发明第三方面提供一种获得结核分枝杆菌全基因组序列的方法。
26、进一步，所述方法采用本发明第一方面所述的引物组合进行结核分枝杆菌的全基因组序列的扩增。
27、进一步，所述方法包括：采用本发明第一方面所述的引物组合针对样品进行pcr扩增、回收并纯化扩增产物、文库扩增、文库纯化、文库质检和测序。
28、进一步，以总体积18μl计，所述pcr扩增的体系包括：reaction mix 2μl、primermix 5μl、dntp mix 2μl、dtt 2μl、dna样品1ng～1μg，余量为水。
29、进一步，上述pcr扩增体系在95℃孵育5min后，加入dnapolymerase 1μl、pyrophosphatase 1μl。
30、进一步，加入上述所述试剂后，所述pcr扩增的反应程序为42℃，2h；65℃，10min；4℃保存。
31、进一步，所述样本包括痰、咽喉拭子、体液、分泌物、穿刺液、粪便等。
32、在本发明中，本领域技术人员了解，对所述扩增反应的反应条件和/或各物质的用量进行适当的调整后，仍然能够发挥对受试者来源的待测样本中的结核分枝杆菌进行检测的目的，因此，如前所述的扩增反应的反应条件和/或各物质的用量并不旨在对本发明的保护范围进行限制，对其进行适当调整后，只要能够发挥扩检测待测样本中的结核分枝杆菌的这一目的，这样经调整后的反应条件和/或各物质的用量也将落入本发明的保护范围内。
33、在一些实施方案中，所述样本来源于有需要的受试者的临床样本，包括但不限于：细胞、组织、体液，例如：皮肤；黏膜；血液；血液衍生物或级份，例如血清；提取的胆汁；活组织检查或手术取出的组织，包括例如未固定的、冷冻的、固定在福尔马林和/或包埋在石蜡中的组织；泪液；乳汁；皮屑；表面清洗液；尿液；痰液；脑脊液；前列腺液；脓；骨髓吸出物；中耳流出物，支气管肺泡灌洗物，气管吸出物，痰液，鼻咽吸出物，口咽吸出物或唾液。
34、在一些实施方案中，所述文库扩增可分为变温扩增和恒温扩增两大类。变温扩增主要包括经典的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称pcr)和连接酶链式反应(ligase chain reaction，简称lcr)，而恒温扩增包括链置换扩增(stranddisplacement amplification，简称sda)、滚环扩增(rolling circle amplification，简称rca)、环介导扩增(loop mediatedamplification，简称lamp)、依赖解旋酶恒温扩增(helicase-dependent isothermal dnaamplification，简称hda)、依赖核酸序列的扩增(nucleic acid sequence based amplification，简称nasba)、转录依赖的扩增系统(transcription-basedamplification system，简称tas)。具体实施例中以pcr为例进行建库。
35、在一些实施例中，所述文库扩增中可以采用包含标签序列(index)的引物。通过使用包含标签序列的引物对连接产物进行扩增，可以区分测序中不同的样品来源的数据，识别样品来源。所述标签序列的设计方法是本领域技术人员所常规熟知的，设计包含标签序列(index)的引物也是本领域技术人员所常规熟知的。
36、在一些实施方案中，所述测序可以通过包括illuminanovaseq、hiseq x ten、illumina hiseq、illumina miseq、pacbio sequel、10×genomics及mgiseq-2000在内的高通量测序平台进行。
37、在本发明具体的实施例中，所述测序通过illuminamiseq平台进行。
38、本发明第四方面提供一种检测结核分枝杆菌的文库。
39、进一步，所述文库包括本发明第一方面所述的引物组合。
40、在一些实施例中，所述文库指储存了大量基因序列的dna或rna样本集合。这些样本被收集、分类、编目和标记，以便科研人员能够方便地查找和使用，从而研究基因的功能或寻找特定基因的克隆。文库的建立过程类似于建立图书馆，都是为了高效地管理和利用大量的信息或物质资源。在结核分枝杆菌的检测中，文库可能包含与该菌相关的多种基因序列，有助于深入了解其生物学特性、致病机制及耐药性等信息。
41、本发明第五方面提供本发明第一方面所述的引物组合在制备扩增或检测结核分枝杆菌核酸序列的产品中的应用。
42、本发明第六方面提供本发明第一方面所述的引物组合或本发明第二方面所述的试剂盒在扩增结核分枝杆菌全基因组序列或在结核分枝杆菌测序中的应用。
43、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：本发明设计的引物组合扩增效率高，基因组覆盖均匀。
1.一种用于结核分枝杆菌全基因组扩增的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括针对结核分枝杆菌细胞基因组设计的20条引物，所述20条引物具有ttcgtcga、cgataccg、cgatcgtc、cttcgtcg、cgaagtcg、cgaatccg、cgaactcg、cgattccg、cgatcagc、gttgaccg、gttgtcgg、gtcgtcg、atcgtcg、tcgtcgg、cgaaccg、gcgaacg、cgtaccg、cgtagcg、cgtcgta、tatcgcg所示的序列。
2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr扩增缓冲液、扩增酶、dtt、dntp、焦磷酸酶、无核酸酶纯水；
4.一种获得结核分枝杆菌全基因组序列的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1所述的引物组合进行结核分枝杆菌的全基因组序列的扩增。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1所述的引物组合针对样品进行pcr扩增、回收并纯化扩增产物、文库扩增、文库纯化、文库质检和测序。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以总体积18μl计，所述pcr扩增的体系包括：reaction mix 2μl、primer mix 5μl、dntp mix 2μl、dtt 2μl、dna样品1ng～1μg，余量为水；
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述样本包括痰、咽喉拭子、体液、分泌物、穿刺液、粪便等。
8.一种检测结核分枝杆菌的文库，其特征在于，所述文库包括权利要求1所述的引物组合。
9.权利要求1所述的引物组合在制备扩增或检测结核分枝杆菌核酸序列的产品中的应用。
10.权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的试剂盒在扩增结核分枝杆菌全基因组序列或在结核分枝杆菌测序中的应用。
