本发明属于微生物检测领域，涉及一种引物对及其应用，特别涉及一种用于检测两歧双歧杆菌的特异性引物对及其在制备检测制剂等方面的应用。
背景技术：
1、近年来，肠道微生物群落与人类健康的关联研究成为微生物学领域的重要焦点。益生菌作为一类能够定殖于人体肠道、生殖系统，并通过调节微生态平衡促进宿主健康的活性微生物，在维持健康方面发挥着重要作用。为了评估益生菌的效果，了解它们在体内的定殖状态至关重要，因为这不仅影响其生物利用度，还决定了它们能否有效发挥作用。
2、在众多用于评估益生菌定殖能力的技术中，有几种方法尤为突出。荧光成像是通过给益生菌标记荧光蛋白，进而追踪这些菌株在肠道中的分布及其数量变化。宏基因组测序则提供了一种全面分析微生物多样性的手段，通过测序可以确定目标菌株的相对丰度。此外，传统的活菌计数法依靠特定的选择性培养基来直接计数目标菌株的数量。最后，qpcr技术凭借其高灵敏度和特异性，成为了在门、科、属乃至种水平上定量检测菌株的有效工具。尽管如此，由于设计特异性引物存在难度，加之复杂菌群背景下的干扰，使得单株菌的精确定量仍面临挑战。
3、在申请人的前期研究中，如cn202410604905.3，已经发现能利用特定的两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)来缓解抗肿瘤治疗相关性腹泻，并在体内外研究中已初步验证了其潜在的应用价值。通过开发此类益生菌补充剂，有可能减轻化疗等抗肿瘤治疗所带来的副作用。而检测患者肠道中是否存在这些活性细菌，以及在使用该活性细菌后检测其定殖情况，对于评估患者对抗肿瘤治疗相关性腹泻的抵抗力以及制定个性化的医疗方案具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于检测粪便等复杂环境样本中两歧双歧杆菌bbifi-1的特异性引物及其应用，为检测两歧双歧杆菌bbifi-1提供高效、精准的鉴别方法，从而解决动物药效实验和临床中面临的定殖检测及菌株鉴别等问题。
2、本发明提供的特异性引物满足阴性对照(无dna模板)无条带、阳性对照(单菌dna)单一条带的要求，且适用于粪便dna样本的检测，表明该引物可用于两歧双歧杆菌bbifi-1的定性或定量检测。
3、为了解决现有技术中存在的问题，本发明第一方面提供一种引物对，在所述引物对中，引物下游与模板互补的序列分别如seq id no.9与seq id no.10所示，或者所述引物对的序列分别如seq id no.9与seq id no.10所示。
4、当一个引物上游有若干未配对碱基(尾巴)或者有分子标记(例如，荧光分子)，不影响这对引物扩增效果，至少可以用凝胶电泳来表征扩增产物。
5、本发明第二方面提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有第一方面所述的引物对。
6、本发明第三方面提供一种非诊断目的检测微生物保藏编号为cctcc no:m2023349的两歧双歧杆菌的方法，包括：采用第一方面所述的引物对或第二方面所述的试剂盒，检测待检样本中的基因组模板。
7、非诊断目的检测微生物保藏编号为cctcc no:m2023349的两歧双歧杆菌的方法的一种应用场景为：为了研究bbifi-1与其他细菌的竞争优势，将二者混合后培养，然后检测培养物中bbifi-1的绝对或相对含量，从而了解两种细菌在共同生态环境中的竞争优势及竞争机制。
8、在一些实施方式中，前述的检测方法，通过pcr方法，检测扩增产物的电泳图片，判断所述待检测样本中是否含有该微生物；或者通过qpcr方法，判断所述待检测样本中是否含有该微生物。
9、本发明第四方面提供前述的引物对在制备用于评价益生菌治疗效果的试剂中的用途，所述益生菌为微生物保藏编号为cctcc no:m2023349的两歧双歧杆菌。
10、在一些实施方式中，如第四方面所述的用途，所述治疗效果是指治疗化疗药引起的腹泻的效果，或者治疗放射治疗引起的腹泻的效果，或者治疗铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血性弧菌和艰难梭菌中的任一种或两种及以上引起的腹泻的效果。
11、在一些实施方式中，所述化疗药选自5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞、阿糖胞苷、阿霉素、表阿霉素、放线菌素d、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、白蛋白紫杉醇、顺铂、卡铂、奈达铂、草酸铂、洛铂、环磷酰胺、氮芥、卡莫司汀、喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康及其衍生物。
12、bbifi-1具有安全和有效改善多种肠道健康状况的特点，特别是改善前述腹泻的用途。将其用作益生菌来调节人类健康状况时，可通过第一方面所述的引物对，或第二方面所述的试剂盒来检测施用bbifi-1后肠道内容物或粪便中bbifi-1的绝对含量或相对含量，以此评价bbifi-1的实际或近似的作用状态。因此，本发明第四方面的用途是基于本发明实际贡献的用途。
13、本发明第五方面提供前述第一方面的引物对在制备用于为肿瘤患者制定或调整治疗方案的试剂中的用途。
14、bbifi-1能够降低感染腹泻、化疗药物(例如，5-氟尿嘧啶)或放射治疗引起的腹泻与对肠道的损伤，因此，针对患者肠道内存在bbifi-1与否，或者bbifi-1的定殖量，可以调整抗癌药物的种类或剂量。通过本发明第一方面所述的引物对，或第二方面所述的试剂盒，检测肠道内容物或粪便中bbifi-1，能够为肿瘤患者制定或调整治疗方案提供参考数据。因此，本发明第五方面的用途也是基于本发明实际贡献的用途。
15、在一些实施方式中，如前第四和第五方面所述的用途，其实现方法包括：定性或定量检测受试者肠道内容物或粪便中的微生物保藏编号为cctcc no:m2023349的两歧双歧杆菌。
16、本发明的优势在于成功筛选出一种针对两歧双歧杆菌bbifi-1的特异性引物，该引物在复杂环境样本中表现出高精准度，能够有效地从混合菌群中特异性地识别并准确检测两歧双歧杆菌，从而显著提升了检测的准确性和可靠性。
1.一种引物对，其特征在于，在所述引物对中，引物下游与模板互补的序列分别如seqid no.9与seq id no.10所示，或者所述引物对的序列分别如seq id no.9与seq id no.10所示。
2.一种试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求所述的引物对。
3.一种非诊断目的检测微生物保藏编号为cctcc no:m2023349的两歧双歧杆菌的方法，包括：采用权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒，检测待检样本中的基因组模板。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，通过pcr方法，检测扩增产物的电泳图片，判断所述待检测样本中含有的微生物；或者通过qpcr方法，判断所述待检测样本中含有的微生物。
5.权利要求1所述的引物对在制备用于评价益生菌的治疗效果的试剂中的用途，所述益生菌为微生物保藏编号为cctcc no:m2023349的两歧双歧杆菌。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述治疗效果是指治疗化疗药引起的腹泻的效果，或者治疗放射治疗引起的腹泻的效果，或者治疗铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血性弧菌和艰难梭菌中的任一种或两种及以上引起的腹泻的效果。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述化疗药选自5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞、阿糖胞苷、阿霉素、表阿霉素、放线菌素d、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、白蛋白紫杉醇、顺铂、卡铂、奈达铂、草酸铂、洛铂、环磷酰胺、氮芥、卡莫司汀、喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康及其衍生物。
8.权利要求1所述的引物对在制备用于为肿瘤患者制定或调整治疗方案的试剂中的用途。
9.如权利要求5或8所述的用途，其特征在于，所述用途的实现方法包括：定性或定量检测受试者肠道内容物或粪便中的微生物保藏编号为cctccno:m2023349的两歧双歧杆菌。
