本发明属于病毒检测，尤其涉及一种用于非洲猪瘟分型、野毒和缺失毒鉴别和检测的引物探针组合和试剂盒。
背景技术：
1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是一种急性、烈性和高度接触性的病毒传染病，由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)感染引起。asfv的自然宿主为家猪、野猪和钝缘蜱，主要可通过消化道、呼吸道和虫媒进行传播。其具有对环境的抵抗力强，在猪群中潜伏期变化范围大、传播力强、致死率高。asf自1921年在肯尼亚发现，至今已在非洲、亚洲、欧洲和加勒比海地区近50个国家暴发和流行，严重危害全球养猪业及相关产业的稳定发展，给社会造成了巨大经济损失。2018年asf首次传入中国，并首次分离基因ⅱ型强毒株(asfv hlj/18)，接种猪死亡率为100％。随后2020年出现基因ⅱ型弱毒株(hlj/hrb1/20)，2021年出现基因i型弱毒株(sd/dy-i/21)，2023年出现基因i型与ii型自然重组的i型强毒株(js/lg/21)，该重组株对家猪具有高度致死性和传播力，使中国asf防控面临更为严峻的挑战。
2、目前，尚无批准应用的asf疫苗，因此通过病原学检测进行有效监测并及时清除传染源仍然是防控asf的主要措施。asfv的p72蛋白保守性强且免疫原性好，不仅作为诊断的结构蛋白，也成为荧光定量检测及分型的重要靶标基因。随着asf流行态势的变化，以及asfv变异株的出现，cd2v、mgf、i177l等基因在自然弱毒株和构建的基因缺失株当中被关注研究。
3、然而，目前报道的asfv鉴定方法大部分为asfv基因i型和ii型分型检测，或者是对基因缺失毒株与野生型毒株的鉴别，这些检测均无法同时快速准确地满足基因分型和病毒毒力鉴别。这些检测方法虽然在特定应用场景中表现良好，但它们无法同时快速且准确地实现基因分型和病毒毒力的鉴别。当简单的将不同病毒的引物和探针进行组合时，由于需要针对多种基因位点进行同时检测，会导致检测体系复杂性增加，引起不同检测位点间的互相干扰，这种互相干扰会降低整体检测灵敏度，导致漏检和误检的问题。因此，针对asfv基因建立一种快速、低成本、灵敏高、使用简便、能特异性地区分基因i型和ii型病毒，同时能够鉴别基因缺失毒株与野生型毒株的检测引物探针组合以及试剂盒和方法是目前需要解决的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于非洲猪瘟分型、野毒和缺失毒鉴别和检测的引物探针组合和试剂盒，从而可以满足不同层次兽医检测或研究人员的需要。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
3、首先，本发明提供了一种用于非洲猪瘟分型病毒、野毒和缺失毒鉴别和检测的引物探针组合，所述非洲猪瘟分型病毒为非洲猪瘟i型弱毒，非洲猪瘟i型强毒，非洲猪瘟ⅱ型弱毒，所述野毒为非洲猪瘟ⅱ型野毒，所述缺失毒为i177l基因缺失疫苗毒；
4、所述引物探针组合包括第一引物和第一探针组合，第二引物和第二探针组合，第三引物和第三探针组合，第四引物和第四探针组合，第五引物第五探针组合；
5、所述第一引物的正向引物序列如seq id no.1所示；
6、所述第一引物的反向引物序列如seq id no.2所示；
7、所述第一探针的序列如seq id no.3所示；
8、所述第二引物的正向引物序列如seq id no.4所示；
9、所述第二引物的反向引物序列如seq id no.5所示；
10、所述第二探针的序列如seq id no.6所示；
11、所述第三引物的正向引物序列如seq id no.7所示；
12、所述第三引物的反向引物序列如seq id no.8所示；
13、所述第三探针的序列如seq id no.9所示；
14、所述第四引物的正向引物序列如seq id no.10所示；
15、所述第四引物的反向引物序列如seq id no.11所示；
16、所述第四探针的序列如seq id no.12所示；
17、所述第五引物的正向引物序列如seq id no.13所示；
18、所述第五引物的反向引物序列如seq id no.14所示；
19、所述第五探针的序列如seq id no.15所示。
20、优选地，所述第一探针的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1基团；
21、所述第二探针的5’端标记vic荧光基团，3’端标记bhq1基团；
22、所述第三探针的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2基团；
23、所述第四探针的5’端标记cy5荧光基团，3’端标记mgb基团；
24、所述第五探针的5’端标记cy5.5荧光基团，3’端标记bhq2基团。
25、优选地，所述第一引物的靶基因序列如seq id no.16所示；
26、所述第二引物的靶基因序列如seq id no.17所示；
27、所述第三引物的靶基因序列如seq id no.18所示；
28、所述第四引物的靶基因序列如seq id no.19所示；
29、所述第五引物的靶基因序列如seq id no.20所示。
30、其次，本发明提供了一种用于非洲猪瘟分型病毒、野毒和缺失毒鉴别和检测的多重taqman荧光定量pcr试剂盒，其特在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物探针组合；
31、所述非洲猪瘟分型病毒为非洲猪瘟i型弱毒，非洲猪瘟i型强毒，非洲猪瘟ⅱ型弱毒，所述野毒为非洲猪瘟ⅱ型野毒，所述缺失毒为i177l基因缺失疫苗毒。
32、优选地，所述试剂盒的每20ul pcr扩增体系为：
33、10ul 2×aceq universal u+probe master mix v2，2.5ul引物探针组合，3.5ulddh2o，4ul样品总dna；
34、所述引物探针组合的引物和探针的体积比例为：正向引物：反向引物：探针＝2:2:1。
35、优选地，所述试剂盒用于荧光定量pcr反应时的反应条件为：
36、37℃2min；95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环，同时采集fam、vic、rox、cy5、cy5.5五个通道的荧光值。
37、优选地，所述试剂盒检测后的判定标准如下：
38、当fam通道ct值<40且有明显扩增曲线，vic通道无ct值，rox通道无ct值，cy5通道无ct值，cy5.5通道ct值<40且有明显扩增曲线，结果判定为非洲猪瘟i型弱毒；
39、当fam通道ct值<40且有明显扩增曲线，vic通道无ct值，rox通道ct<40且有明显扩增曲线，cy5通道ct<40且有明显扩增曲线，cy5.5通道ct<40且有明显扩增曲线，结果判定为非洲猪瘟i型强毒；
40、当fam通道无ct值，vic通道ct值<40且有明显扩增曲线，rox通道和cy5通道ct<40中仅有一个有扩增曲线或二者均无扩增曲线，cy5.5通道ct<40且有明显扩增曲线，结果判定为非洲猪瘟ⅱ型弱毒；
41、当fam通道无ct值，vic通道ct<40且有明显扩增曲线，rox通道ct<40且有明显扩增曲线，cy5通道ct<40且有明显扩增曲线，cy5.5通道ct值<40且有明显扩增曲线，结果判定为非洲猪瘟ⅱ型野毒；
42、当fam通道无ct值，vic通道ct<40且有明显扩增曲线，rox通道ct<40且有明显扩增曲线，cy5通道ct<40且有明显扩增曲线，cy5.5通道无ct值，结果判定为i177l基因缺失疫苗毒；
43、当fam通道无ct值，vic通道无ct值，rox通道无ct值，cy5通道无ct值，cy5.5通道无ct值，结果判定为阴性。
44、其次，本发明提供了一种用于非诊断目的的非洲猪瘟分型病毒、野毒和缺失毒鉴别和检测方法，其特征在于，所述非洲猪瘟分型病毒为非洲猪瘟i型弱毒，非洲猪瘟i型强毒，非洲猪瘟ⅱ型弱毒，所述野毒为非洲猪瘟ⅱ型野毒，所述缺失毒为i177l基因缺失疫苗毒；
45、所述方法包括如下步骤：
46、(1)获取检测样本的总dna；
47、(2)按照上述的pcr扩增体系配置试剂；
48、(3)按照上述的反应条件进行pcr扩增；
49、(4)按照上述的判定标准进行结果的判定。
50、其次，本发明提供了引物探针组合在制备非洲猪瘟分型病毒、野毒和缺失毒鉴别和检测的生物制剂中的应用，所述非洲猪瘟分型病毒为非洲猪瘟i型弱毒，非洲猪瘟i型强毒，非洲猪瘟ⅱ型弱毒，所述野毒为非洲猪瘟ⅱ型野毒，所述缺失毒为i177l基因缺失疫苗毒。
51、除此之外，本发明提供了试剂盒在制备非洲猪瘟分型病毒、野毒和缺失毒的鉴别和检测系统中的应用，所述非洲猪瘟分型病毒为非洲猪瘟i型弱毒，非洲猪瘟i型强毒，非洲猪瘟ⅱ型弱毒，所述野毒为非洲猪瘟ⅱ型野毒，所述缺失毒为i177l基因缺失疫苗毒。
52、本发明的有益效果在于：
53、1.本发明提供的引物探针组合和试剂盒可以同时检测非洲猪瘟i型弱毒、i型强毒、ii型弱毒、ii型野毒及i177l基因缺失疫苗毒，满足了对不同基因型及毒力的精准鉴别需求。通过多重taqman荧光定量pcr技术，能够在一次反应中快速区分这些病毒类型，有效提高了检测效率和准确性。
54、2.使用不同荧光标记的探针，确保了各基因位点的特异性检测，避免了不同位点间的交叉干扰。本发明的方法具有极高的敏感性，最低检测限可达2.29copies/μl或4.15copies/μl，确保能够检测到微量的病毒dna，避免漏检。
55、3.通过多次实验验证，本发明的检测方法在组内和组间的变异系数均较低(0.04％-0.89％)，表现出良好的重复性，保证了检测结果的可靠性。
56、4.本发明的引物探针组合和试剂盒适用于非洲猪瘟病毒的不同基因型鉴别，不仅可用于实验室研究，还可在临床诊断和流行病学调查中应用，为非洲猪瘟的防控提供了有力的工具。
57、5.本发明提供的检测体系在pcr操作流程上简单易行，不需要复杂的操作步骤或设备，适合在各种实验室条件下进行推广应用，具有广泛的应用潜力。
58、这些优点使得本发明在非洲猪瘟病毒的精准检测和鉴别中具有重要的实际应用价值，能够有效支持疫病防控措施的制定和实施。
1.一种用于非洲猪瘟分型病毒、野毒和缺失毒鉴别和检测的引物探针组合，其特征在于，所述非洲猪瘟分型病毒为非洲猪瘟i型弱毒，非洲猪瘟i型强毒，非洲猪瘟ⅱ型弱毒，所述野毒为非洲猪瘟ⅱ型野毒，所述缺失毒为i177l基因缺失疫苗毒；
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一探针的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1基团；
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一引物的靶基因序列如seq id no.16所示；
4.一种用于非洲猪瘟分型病毒、野毒和缺失毒鉴别和检测的多重taqman荧光定量pcr试剂盒，其特在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物探针组合；
5.根据权利要求4所述的多重taqman荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的每20ul pcr扩增体系为：
6.根据权利要求5所述的多重taqman荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于荧光定量pcr反应时的反应条件为：
7.根据权利要求6所述多重taqman荧光定量pcr试剂盒，所述试剂盒检测后的判定标准如下：
8.一种用于非诊断目的的非洲猪瘟分型病毒、野毒和缺失毒鉴别和检测方法，其特征在于，所述非洲猪瘟分型病毒为非洲猪瘟i型弱毒，非洲猪瘟i型强毒，非洲猪瘟ⅱ型弱毒，所述野毒为非洲猪瘟ⅱ型野毒，所述缺失毒为i177l基因缺失疫苗毒；
9.如权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合在制备非洲猪瘟分型病毒、野毒和缺失毒鉴别和检测的生物制剂中的应用，其特征在于，所述非洲猪瘟分型病毒为非洲猪瘟i型弱毒，非洲猪瘟i型强毒，非洲猪瘟ⅱ型弱毒，所述野毒为非洲猪瘟ⅱ型野毒，所述缺失毒为i177l基因缺失疫苗毒。
10.如权利要求4-7中任一项所述的试剂盒在制备非洲猪瘟分型病毒、野毒和缺失毒的鉴别和检测系统中的应用，其特征在于，所述非洲猪瘟分型病毒为非洲猪瘟i型弱毒，非洲猪瘟i型强毒，非洲猪瘟ⅱ型弱毒，所述野毒为非洲猪瘟ⅱ型野毒，所述缺失毒为i177l基因缺失疫苗毒。
