本发明涉及生物工程，尤其是涉及一种具有以天冬氨酸为底物的丙二酰辅酶a合成路径的基因重组工程菌株及其应用。
背景技术：
1、丙二酰辅酶a(malonyl-coa)是细胞代谢中的一个必要中间分子，作为各种化合物的生物合成的重要前体。
2、图1为丙二酰辅酶a作为合成前体可生物合成的各种化合物。
3、丙二酰辅酶a的作用跨越多个合成途径，在脂肪酸(脂质、油化学品、多不饱和脂肪酸)、多酮类(黄酮类化合物)和药用化合物(抗生素、大麻素)等方面起着关键作用。丙二酰辅酶a作为脂肪酸生物合成中的起始和延长分子，它可以调节脂肪酸的合成和分解，从而影响能量平衡和细胞功能，但其作用不仅限于代谢，在医学方面，它与人体胰岛素敏感性、心肌能量代谢和癌症进展相关的信号通路都扮演着至关重要的作用。
4、自然界的生物体中存在两种经典的丙二酰辅酶a途径，大多数生物体使用的是pdh-acc标准途径：丙酮酸氧化脱羧为乙酰辅酶a，生成的乙酰辅酶a再羧化形成丙二酰辅酶a。但乙酰辅酶a羧化酶在细菌中由四个不同的亚基组成，在高等生物中则由单个多肽链组成，分子量比较大，因此乙酰辅酶a羧化酶存在低效的缺点，原因包括其需要消耗三磷酸腺苷(atp)、严格的调节机制以及过表达毒性增加的风险。
5、第二种经典途径依赖于依赖atp的丙二酰辅酶a合成酶，它以高能磷酸键为代价，直接酰化丙二酸以形成丙二酰辅酶a。这种反应存在于某些细菌、古细菌和高等生物的线粒体基质中，与酵母细胞利用乙酸直接合成乙酰辅酶a相似。但这两种经典途径都对细胞能量电荷高度敏感性，因此对生物合成有很大瓶颈限制。
6、因此，研究构建一种具有全新的、未经报道的非典型丙二酰辅酶a合成途径的重组工程菌株以提高丙二酰辅酶a的表达，进而提高以丙二酰辅酶a为合成中间体的高价值化合物的产量，变得十分必要和迫切。
7、有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种具有以天冬氨酸为底物的丙二酰辅酶a合成路径的基因重组工程菌株，该基因重组工程菌株可以有效提高细胞内的丙二酰辅酶a的代谢通量。将具有上述合成路径的重组工程菌株应用于耶氏解脂酵母工程菌株的构建，可以有效提高以丙二酰辅酶a为生物合成中间体的高值化合物的产量。
2、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
3、根据本发明的一个方面，一种重组表达载体，所述重组表达载体的骨架载体是pylxp’或purlp，且包括以下可操作性相连的元件：
4、(a)天冬氨酸脱羧酶基因表达系统，该系统从5’到3’依次包括元件：启动子，天冬氨酸脱羧酶基因和终止子；
5、和，(b)单胺氧化酶基因表达系统，该系统从5’到3’依次包括元件：启动子，单胺氧化酶基因和终止子；
6、和，(c)丙二酰辅酶a还原酶基因表达系统，该系统从5’到3’依次包括元件：启动子，丙二酰辅酶a还原酶基因和终止子；
7、所述(a)、(b)、(c)中的启动子为带有内含子序列的tef启动子；
8、所述(a)、(b)、(c)中的终止子为xpr2终止子。
9、本发明提供的重组表达载体，该重组表达载体转染至底盘菌株的感受态细胞后可实现天冬氨酸脱羧酶基因、单胺氧化酶基因和丙二酰辅酶a还原酶基因的共表达，进而为制备可以有效提高细胞内的丙二酰辅酶a的代谢通量的重组细胞提供了基础。
10、在本发明的一种优选实施方式中，所述(c)丙二酰辅酶a还原酶基因表达系统可替换为：
11、coa乙酰化醛脱氢酶基因表达系统，该系统从5’到3’依次包括元件：启动子，coa乙酰化醛脱氢酶基因和终止子；所述启动子为带有内含子序列的tef启动子，所述终止子为xpr2终止子。
12、在本发明的一种优选实施方式中，所述天冬氨酸脱羧酶基因为epand，所述epand的基因序列如seq id no.1所示；
13、具体seq id no.1序列如下：atgatccgaaccatgctgcaaggcaagctgcaccgagtga aggtgacccacgccgacctgcactacgagggctcttgtgccatcgaccaagacttcctggacgccgccggcatcctggagaacgaggccatcgacatctggaacgtgaccaacggcaagcgattctctacctacgccatcgccgccgagcgaggctctcgaatcatctctgtgaacggcgccgctgcccactgtgcctctgtgggcgacatcgtgatcatcgcctctttcgtgaccatgcccgacgaggaggcccgaacctggcgacccaacgtggcctacttcgagggcgacaacgagatgaagcgaaccgccaaggccatccccgtgcaagtggcc。
14、在本发明的一种优选实施方式中，所述单胺氧化酶表达基因为etyna，所述etyna的基因序列如seq id no.2所示；
15、具体seq id no.2序列如下：atgggctctccctctctgtactctgcccgaaagactactct ggccctggccgtcgccctgtctttcgcctggcaagcccccgtgttcgcccacggcggcgaggcccacatggtgcccatggacaagaccctgaaggagttcggcgccgacgtgcagtgggacgactacgctcagctgttcaccctgatcaaggacggcgcctacgtgaaggtgaagcccggcgctcagaccgccatcgtgaacggacagcccctggccctgcaagtgcctgtggtcatgaaggacaacaaggcctgggtgtctgacaccttcatcaacgacgtgtttcagtctggcctggatcagaccttccaagtggagaagcgaccccaccccctgaacgccctgaccgccgacgagatcaagcaagccgtggagatcgtgaaggcctctgccgacttcaagcccaacactcgattcaccgagatctctctgctgccccccgacaaggaagccgtgtgggccttcgccctggagaacaagcccgtggatcagccccgaaaggccgacgtgatcatgctggacggcaagcacatcatcgaggccgtcgtggacctccaaaataacaagctgctgtcttggcagcccatcaaggacgcccacggcatggtgctgctggacgacttcgcctctgtgcagaacatcatcaacaactctgaggagttcgccgctgccgtgaagaagcgaggcatcaccgacgccaagaaggtgatcaccacccccctgaccgtgggctacttcgacggcaaggacggcctgaagcaagacgcccgactgctgaaggtgatctcttacctggacgtcggcgacggcaactactgggcccaccccatcgagaacctggtggctgtggtggacctggagcaaaagaagatcgtgaagatcgaggagggccccgtggtgcccgtgcccatgaccgcccgacccttcgacggccgagatcgagtggcccccgccgtgaagcccatgcagatcatcgagcccgagggcaagaattacaccatcaccggcgacatgatccactggcgaaactgggacttccacctgtctatgaactctcgagtgggccccatgatctctaccgtcacctacaacgacaacggcaccaagcgaaaggtgatgtacgagggctctctgggcggcatgatcgtgccctacggcgaccccgacatcggctggtacttcaaggcctacctggactctggcgactacggcatgggcaccctgacctctcccatcgcccgaggcaaggacgccccctctaacgccgtgctgctgaacgagaccatcgccgactacaccggcgtgcccatggagatcccccgagccatcgccgtgttcgagcgatacgccggccccgagtacaagcaccaagagatgggacagcccaacgtgtctaccgagcgacgagagctggtggtgcgatggatctccaccgtgggcaactacgactacatcttcgactggatcttccacgagaacggcaccatcggcatcgacgccggcgccaccggcatcgaagccgtgaagggcgtgaaggccaagaccatgcacgacgagaccgccaaggacgacacccgatacggcaccctgatcgaccacaacatcgtgggcactactcatcagcacatctacaacttccgactggacctggacgtggacggcgagaacaactctctggtggccatggaccccgtggtgaagcccaatactgccggcggcccccgaacctctaccatgcaagtgaatcagtacaacatcggcaacgagcaagacgccgctcagaagttcgaccccggcaccatccgactgctgtctaaccccaacaaggagaaccgaatgggcaaccccgtgtcttatcagatcatcccctacgccggcggcacccaccccgtggccaagggcgctcagttcgcccccgacgagtggatctaccaccgactgtctttcatggacaagcagctgtgggtgacccgataccaccccggcgagcgattccccgagggaaagtaccccaaccgatctacccacgacaccggcctgggacagtactctaaggacaacgagtctctggacaacaccgatgccgtcgtctggatgaccaccggcaccacccacgtggctcgagccgaggagtggcccatcatgcccaccgagtgggtgcacaccctgctgaagccctggaacttcttcgacgagacccccaccctgggcgccctgaagaaggacaag。
16、在本发明的一种优选实施方式中，所述丙二酰辅酶a还原酶表达基因为mcr-c，所述mcr-c的基因序列如seq id no.3所示；
17、具体seq id no.3序列如下：atggccgacctgtctgccaccaccggcgcccgatctgcct ctgtgggctgggccgagtctctgatcggcctgcacctgggcaaggtggccctgatcaccggaggctccgccggcatcggaggacagatcggccgactgctggccctgtctggcgcccgagtgatgctggccgcccgagaccgacacaagctggagcagatgcaagccatgattcagtctgagctggccgaggtgggctacaccgacgtggaggaccgagtgcacatcgcccccggatgtgacgtgtcttctgaggctcagctggccgacctggtggagcgaaccctgtctgccttcggcaccgtggactacctgatcaacaacgccggcatcgccggcgtggaggagatggtgatcgacatgcctgtggagggctggcgacacaccctgttcgctaacctgatttctaactactctctgatgcgaaagctggcccccctgatgaagaagcaaggctctggctacatcctgaacgtgtcttcttacttcggcggcgagaaggacgccgccatcccctaccccaaccgagccgactacgccgtgtctaaggccggacagcgagccatggccgaggtgttcgcccgattcctgggccccgaaattcagatcaacgccattgcccctggccctgtcgaaggcgaccgactgcgaggaaccggcgaacgacccggcctgttcgcccgacgagctcgactcatcctggagaacaagcgactgaacgagctgcacgccgccctgatcgccgctgcccgaaccgacgagcgatctatgcacgagctggtggagctgctcctgcccaatgacgtggccgccctggaacagaaccctgccgcccccaccgccctgcgagagctggcccgacgattccgatctgagggcgaccccgccgcctcttcctcttctgccctgctgaaccgatctatcgccgccaagctgctggcccgactgcacaacggcggctacgtgctgcccgccgacatcttcgccaacctgcccaacccccccgaccccttcttcacccgagctcagatcgaccgagaggcccgaaaggtgcgagacggcatcatgggcatgctgtacctgcagcgaatgcccaccgagttcgacgtggccatggccaccgtgtactacctggccgaccgagtggtgtctggcgagaccttccacccctctggcggcctgcgatacgagcgaacccctaccggcggcgaactcttcggcctgccctctcccgagcgactggccgagctggtgggctctaccgtgtacctgatcggcgagcacctgaccgagcacctgaacctgctggctcgagcctacctggagcgatatggcgcccgacaagtggtgatgatcgtggagaccgagaccggcgccgagaccatgcgacgactgctgcacgaccacgtggaggccggccgactgatgaccatcgtggccggcgatcagatcgaggccgccattgaccaagccatcacccgatacggacgacccggccccgtggtgtgtacccccttccgacccctccctaccgtgcccctggtgggccgaaaggactctgactggtctaccgtgctgtctgaggccgagttcgccgagctgtgtgagcatcagctgacccaccacttcagagtggcccgatggatcgccctgtctgacggcgctcgactggctctcgtcacccccgagaccaccgccacctctaccaccgagcagttcgccctggccaacttcatcaagaccaccctgcacgccttcaccgccaccatcggcgtggagtctgagcgaaccgctcagcgaatcctgatcaaccaagtggacctgacccgacgagcccgagccgaggagcctcgagacccccacgagcgacagcaagagctggagcgatttattgaggctgtgctgctggtgaccgctcccctgcctcccgaggccgacactcgatacgccggccgaatccaccgaggccgagccatcaccgtg。
18、在本发明的一种优选实施方式中，所述coa乙酰化醛脱氢酶表达基因为stpdup，所述stpdup的基因序列如seq id no.4所示。
19、具体seq id no.4序列如下：atgaacacctctgagctggagaccctgatccgaaccatcc tgtctgagcaactgaccacccccgctcagacccccgtgcagccccaaggcaagggcatctttcagtctgtgtctgaggccatcgacgccgcccaccaagccttcctgcgatatcagcagtgtcccctgaagacccgatctgccatcatctctgccatgcgacaagagctgacccccctgctcgcccccctggccgaggagtctgccaacgagaccggcatgggcaacaaggaggacaagttcctgaagaacaaggctgccctggacaacactcccggcgtggaggatctgactaccaccgccctgaccggcgacggcggcatggtgctgttcgagtactctcccttcggcgtgatcggctctgtggccccctctaccaaccccaccgagaccatcatcaacaactctatctctatgctggccgccggcaactctatctacttctctccccaccccggcgccaagaaggtgtctctgaagctgatctctctgatcgaggagatcgccttccgatgttgtggcatccgaaacctggtggtgaccgtggccgagcccaccttcgaggccactcagcagatgatggcccacccccgaatcgccgtgctggccatcaccggcggccccggcatcgtggccatgggcatgaagtctggcaagaaggtgatcggcgccggcgccggcaaccccccctgtatcgtggacgagaccgccgacctggtgaaggccgccgaggacatcatcaacggcgcctctttcgactacaacctgccctgtatcgccgagaagtctctgatcgtggtggagtctgtggccgagcgactggtgcagcagatgcagaccttcggcgccctgctcctgtctcccgccgacaccgacaagctgcgagccgtgtgtctgcccgagggccaagccaacaagaagctggtgggcaagtctccctctgctatgctggaggccgccggcatcgccgtgcccgccaaggcccctcgactcctgatcgccctggtgaacgccgacgacccctgggtgacctctgagcagctgatgcccatgctgcccgtggtgaaggtgtctgacttcgactctgccctggccctggccctgaaggtggaggagggcctgcaccacaccgccatcatgcactctcagaacgtgtctcgactgaacctggccgcccgaaccctgcagacctctatcttcgtgaagaacggcccctcttacgccggcatcggcgtgggcggcgagggcttcaccaccttcaccatcgccacccccaccggcgagggcaccacctctgcccgaaccttcgcccgatctcgacgatgtgtgctgaccaacggcttctctatccga。
20、根据本发明的一个方面，一种具有以天冬氨酸为底物的丙二酰辅酶a合成路径的基因重组工程菌株，所述重组工程菌株含有上述重组表达载体；
21、优选地，所述重组工程菌株的底盘菌株包括：耶氏解脂酵母菌株、酿酒酵母菌株、毕赤酵母菌株、大肠杆菌菌株中的任意一种。
22、图2为本技术提供的丙二酰辅酶a的人工合成路径图。
23、图2中的合成路径具体包括：
24、s1：利用重组工程菌株中表达的天冬氨酸脱羧酶(adc)将底物天冬氨酸(aspartate)转化为β-丙氨酸(β-alanine)；
25、s2：β-丙氨酸被重组工程菌株中表达的单胺氧化酶(mao)氧化形成丙二酸半醛(malsa)；
26、s3：丙二酸半醛(malsa)被重组工程菌株中表达的丙二酰辅酶a还原酶或coa乙酰化醛脱氢酶(mcr-c/aldh)催化，与辅酶a(coash)结合，形成丙二酰辅酶a。
27、参见图2可知，本技术提供了一种全新的非典型丙二酰辅酶a合成途径adc-mao-mcr途径(amm)，该合成途径能够以天冬氨酸为底物经生物合成得到丙二酰辅酶a，进而有效提高细胞内的丙二酰辅酶a的代谢通量，
28、需要说明的是，天冬氨酸脱羧酶(adc)可将天冬氨酸转化为β-丙氨酸，这种初级脂肪胺可被单胺氧化酶(mao)进一步氧化形成丙二酸半醛malsa；amm路径所产生的代谢物丙二酸半醛(malsa)经丙二酰辅酶a还原酶(mcr)或者coa乙酰化醛脱氢酶(aldh)作用，可以高效提高细胞内的丙二酰辅酶a的代谢通量，进而用于高值化合物的合成。
29、根据本发明的一个方面，一种具有以天冬氨酸为底物的丙二酰辅酶a合成路径的基因重组工程菌株在制备目标产物高产工程菌株中的应用；
30、本发明提供的具有以天冬氨酸为底物的丙二酰辅酶a合成路径的基因重组工程菌株可广泛应用于目标产物高产工程菌株的制备过程中。
31、需要说明的是，丙二酰辅酶a在多个行业中具有显著的商业化潜力。例如：在制药领域，它可以作为治疗和诊断糖尿病、肥胖等代谢疾病的靶点。在生物技术领域，它有助于生物柴油、生物塑料和高价值化学品的生物合成，在健康领域，它可以用来合成高价值的ω-3或者ω-6多不饱和脂肪酸dha或者epa，可以用在婴幼儿奶粉添加剂中，此外，它也可以用在各种多肽类抗生素药物的合成，也包括大环内酯类抗生素和天然止痛剂大麻素的合成等。此外，在护肤品市场中，丙二酰辅酶a衍生物可以通过改善脂质代谢来增强抗衰老产品的效果。因此，本技术提供的以天冬氨酸为底物的丙二酰辅酶a合成路径在健康、食品、能源和化妆品领域的应用具有广泛的市场机会。
32、优选地，所述目标产物为以丙二酰辅酶a为生物合成中间体的产物；
33、更优选地，所述以丙二酰辅酶a为生物合成中间体的产物包括：三乙酸内酯、柚皮素、苔色酸和橄榄醇酸中的一种。
34、根据本发明的一个方面，一种耶氏解脂酵母工程菌株的构建方法，，所述构建方法包括：
35、(a)利用上述重组表达载体转染耶氏解脂酵母菌株的感受态细胞，培养得到转化子；
36、(b)分离转化子基因组中整合有以下可操作性相连的元件：
37、带有内含子序列的tef启动子，天冬氨酸脱羧酶基因和xpr2终止子；
38、带有内含子序列的tef启动子，单胺氧化酶基因和xpr2终止子；
39、带有内含子序列的tef启动子，丙二酰辅酶a还原酶基因和xpr2终止子；
40、的菌株，得到重组工程菌株。
41、优选地，所述丙二酰辅酶a还原酶基因可替换为coa乙酰化醛脱氢酶基因。
42、在本发明的一种优选实施方式中，所述耶氏解脂酵母菌株的感受态细胞具备合成三乙酸内酯、柚皮素、苔色酸或橄榄醇酸中的任意一种的能力。
43、本发明提供的耶氏解脂酵母工程菌株的构建方法，该构建方法将具有adc-mao-mcr/aldh途径(amm)的重组表达载体整合到具备合成三乙酸内酯，柚皮素，苔色酸和橄榄醇酸的不同耶氏解脂酵母底盘菌株的基因组中。经验证，可有效提高转化得到的耶氏解脂酵母工程菌株中三乙酸内酯，柚皮素，苔色酸或橄榄醇酸的产量。
44、在本发明的一种优选实施方式中，所述耶氏解脂酵母底盘菌株为尿嘧啶ura和亮氨酸leu双缺陷型，该营养双缺陷型菌株可以方便结合其他基因敲除和基因重组工具载体进行同步改造，提高基因改造工程效率
45、根据本发明的一个方面，一种耶氏解脂酵母工程菌株，所述耶氏解脂酵母工程菌株主要由上述构建方法制备得到。
46、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
47、本发明提供的重组表达载体转染至底盘菌株的感受态细胞后可实现天冬氨酸脱羧酶基因、单胺氧化酶基因和丙二酰辅酶a还原酶基因的共表达，进而可以在转化细胞中实现以天冬氨酸为底物经生物合成得到丙二酰辅酶a的合成路径(amm)，有效提高细胞内的丙二酰辅酶a的代谢通量。同时，使用上述重组表达载体构建得到的耶氏解脂酵母工程菌株，经验证可显著提高耶氏解脂酵母工程菌株中以丙二酰辅酶a为生物合成中间体的高值化合物的产量。
1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的骨架载体是pylxp’或purlp，且包括以下可操作性相连的元件：
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述(c)丙二酰辅酶a还原酶基因表达系统可替换为：
3.根据权利要求1或2任一项所述的重组表达载体，其特征在于，所述天冬氨酸脱羧酶基因为epand，所述epand的基因序列如seq id no.1所示；
4.一种具有以天冬氨酸为底物的丙二酰辅酶a合成路径的基因重组工程菌株，其特征在于，所述重组工程菌株含有权利要求1～3任一项所述的重组表达载体；
5.根据权利要求4所述重组工程菌株，其特征在于，所述以天冬氨酸为底物的丙二酰辅酶a合成路径包括：
6.权利要求4或5任一项所述的具有以天冬氨酸为底物的丙二酰辅酶a合成路径的基因重组工程菌株在制备目标产物高产工程菌株中的应用；
7.一种耶氏解脂酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
8.根据权利要求7所述的耶氏解脂酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，所述耶氏解脂酵母菌株的感受态细胞具备合成三乙酸内酯、柚皮素、苔色酸或橄榄醇酸中的任意一种的能力。
9.根据权利要求7所述的耶氏解脂酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，所述耶氏解脂酵母菌株为尿嘧啶ura和亮氨酸leu双缺陷型。
10.一种耶氏解脂酵母工程菌株，其特征在于，所述耶氏解脂酵母工程菌株主要由权利要求7～9任一项所述的构建方法制备得到。
