本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种高产荆芥内酯重组酿酒酵母工程菌及其优化方法与应用。
背景技术：
1、荆芥内酯是一种有双环的类单萜，其分子含有两个稠合的环，分别是环戊烷和一个六元内酯。荆芥内酯主要是猫薄荷（nepeta cataria）中所含的活性化学物质，具有挥发性。荆芥内酯作为猫薄荷中引起猫科动物兴奋的主要成分，通过与猫鼻腔表皮细胞上的蛋白受体结合，传递并刺激猫的大脑，导致猫产生滚动、抓挠和呼噜声等各种反应。荆芥内酯具有驱虫、安眠、抗菌等作用，在医药领域，可用于生产安眠药、抗痉挛药、退热药等。此外荆芥内酯在驱虫方面也有广泛应用，可用于驱除蟑螂、蚊子、蝇类等。荆芥内酯与氢气加成可生成二氢荆芥内酯，二氢荆芥内酯是一种高效驱虫化合物，其驱蚊能力是主流成分避蚊胺（deet）的数倍。
2、天然荆芥内酯主要从猫薄荷中分类提取，化学合成荆芥内酯则是以柠檬烯或荆芥酸或香茅醛为起始原料合成，生产效率低、成本高，产量不足导致其无法实现规模化应用，为解决相关问题，微生物合成荆芥内酯的工艺正受到市场广泛关注。近年来，人们对荆芥内酯的生物合成路径进行了深入解析。如图1所示，荆芥内酯的生物合成路径是以葡萄糖为底物，经由mva路径生成香叶醇。香叶醇通过p450酶g8h催化生成8-羟基香叶醇，而后通过hgo酶进行两步连续氧化生成8-氧代香叶醛，经过isy酶还原生成烯醇中间体，自发或经由mlpl酶环化生成荆芥醇。荆芥醇最后通过neps1酶催化生成荆芥内酯。
3、2019年，研究人员采用基于酵母的全细胞生物催化方法，通过四步酶促过程从8-羟基香叶醇生产荆芥内酯，单因素优化后使用因子设计和响应面方法进行多因素优化，使荆芥内酯产量提升5.8倍至153 mg/l。
4、2021年，研究人员进行多步、一锅法体外反应，以香叶醇为底物，在g8h和gor反应完成后再添加isy，将路径中的9种酶与香叶醇一起孵育，8.5h生成930 mg/l荆芥内酯（每隔1.5h需要补料香叶醇）。
5、2021年，研究人员首次在酿酒酵母中实现荆芥内酯的合成，产量仅仅达到3.10mg/l/od600（od600约为5-6）。这是目前唯一成功从头生物合成荆芥内酯的案例，然而由于产量过低，难以替代传统工艺进行大规模的生产。
6、2024年，研究人员在毕赤酵母中实现荆芥醇（荆芥内酯前体）的合成。通过构建过氧化物酶体、细胞质双定位的酵母工厂，而后对两种酵母进行交配，生成二倍体酵母，24孔板产量为1172.6 mg/l，5l发酵罐产量为4429.4 mg/l。
7、到目前为止，在异源宿主中进行荆芥内酯合成的难度在于路径中基因与基因之间、路径基因与底盘之间的适配问题以及isy酶的催化特异性分配问题，isy酶既可以将8-氧代香叶醛还原为烯醇中间体，又能够将香叶醇还原为副产物香茅醇，严重制约了荆芥醇、荆芥内酯乃至下游路径的通量。体外合成荆芥内酯侧重于通过添加中间体、或是分步添加isy酶，尽力避免副产物的生成。但是由于体外反应需要复杂的体系和反应程序，不利于工业生产。从头生物合成荆芥内酯逐渐进入研究者的视线，但是由于产量过低（3.10 mg/l/od600，od600约为5-6），难以代替传统方法进行生产。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种高产荆芥内酯重组酿酒酵母工程菌及其优化方法与应用。本发明通过利用系统工程策略（酶融合表达、调节内源辅因子平衡）和代谢过程优化（染色体整合、两相发酵、营养缺陷标签补齐）的手段，实现荆芥内酯的高效合成，进而获得一株稳定高产荆芥内酯的酿酒酵母菌株。本发明确定了前体底物对整条异源路径的必要性，以及荆芥内酯的异源合成路径对内源代谢产生了辅因子不平衡扰乱，为后续继续优化提产异胡豆苷、长春碱提供有利证据。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了基因组合，包括：crhgo基因、nmisy基因和neps1基因。
4、在本发明的一些实施方案中，上述基因组合，还包括：mlpl基因和/或zwf1基因。
5、在本发明的一些实施方案中，上述基因组合，上述crhgo基因序列如seq id no:1所示：atgactaaaacaaattctccagctccatcagttattacttgtaaagctgcagttgtttggaaatctggtgaaccaccaaaagttgaagaaattcaagttgatccaccaaaggcatctgaagttagaattaaaatgttgtgtgcttcattgtgtcatactgatttcttggcatgtaatggtttaccagttccattgtttccaagaattccaggtcatgaaggtgttggtatgatcgaatctgttggtgaaaacgttacaaatttgaaggaaggtgacatcgttatgccattatatttgggtgaatgtggtgaatgtttgaactgtaagtctggtagaacaaatttgtgtcataagtacccattgggtttttcaggtttgttattggatggtacttctagaatgtcaatcggtgaacaaaaggtttaccatcatttctcttgttcaacatggtctgaatacatcgttatcgaagctgcatacgctgttaaagttgatccaagagtttctttgccacatgcatcatttttatgttgtggttttactacaggttttggtgctacttggagagatgttaatgttgttaaaggttcaacagttgctgttttaggtttgggtgcagttggtttgggtgctgttcaaggtgcaaaatctcaaggtgcttcaagaatcatcggtttagatatcaacgataagaaaagagaaaaaggtgaagcattcggtatgacagaattcattaacccaaagggttctaataagtctatctcagaattgattaatgaagctactggtggtttaggtttggattatgtttacgaatgtacaggtgttccagctttgttgaacgaagcaatcgaatcttcaaaagttggtttaggtactgctgttttgattggtgcaggtttagaaacatcaggtgaaattaagtttattccattgttgtgtggtagaactgttaaaggttctatctatggtggtgttagaccaaagtcagatttgccaacattgatcgaaaagtgtatcaataaggaaattccaatggatgaattgatgactcatgaagtttctttgtcagaaattaataagggtttcgaatacttaaagcatccagattgtgttaaagttgttattaaattttga。
6、在本发明的一些实施方案中，上述基因组合，上述nmisy基因序列如seq id no:2所示：atgtctttgtcatggtggagagctggtgctgctaagaaaagaatggatgatgatgaatctttgttggttaagcaacaacaacaacaatgtgttgctttaattgttggtgttactggtttggttggtaattcattagcagaaatgttgccattaccagatacaccaggtggtccatggaaagtttatggtgttgctagaagagcaagaccatcttggaatgaagatcaaccaatgacttacatctcttgtgatgtttcaaacacaggtgaagttgaagctaaattgtctccattatcagatgttactcatattttctatgcaacttggacatctagatcaacagaagaagaaaactgtgaagctaacggtaaaatgttgaaaaatgttttggatgcaatgatcccaaactgtccaaatttgaagcatatctgtttacaaactggtagatttcattacgttgcttctgttgttgattggaagattaatggttcacatgatactccattgacagaagatttgccaagattgaagactaacaacttctactacacacaagaagatatcttgttggaagaagttaagagaaaggaaggtttaacttggtctgttcatagaccaggtacaatcttcggtttttctccatactcaatgatgaatttggttggtacattatgtgtttacgctgcaatttgtaaacaagaaggtgctgttttgagatttccaggttgtaaaggtgcatgggatggtcattctgattgtgctgatgcagatttgattgcagaacaacaaatttgggctgcattagatccacatgctaaaaatcaagcttttaatgtttcaaacggtgacttgtttaaatggaagcatttgtggaaggttttggctgatcaatttggtgttgaatgtggtgactatgaagaaggtcaacaattgagattgcaagatgttatgaaggataagggtccagtttgggataagatcgttgcagaaaacggtttgtctaacactaagttggaagatgttggtaaatggtggttctcagatacaatcttgtggaacgaatgtagattggattctatgaataagtcaaaggaacatggtttcttgggttttagaaactctaaaaattgtttcttgtactggatccataaggttaaggcttacaatttggttccatcaacttacacataa。
7、在本发明的一些实施方案中，上述基因组合，上述neps1基因序列如seq id no:3所示：atggcatccaccgctaacccaatgcaagttatgaaaaagaaattggaaggtaaggttgttattgttaccggtggtgcttccggtattggtcaaactgctgctagagtttttgctcaacatggtgctagagctgttgttattgctgatattcaatccgaagttggtaagtctgttgctaaaagtattggtgatccttgttgttatgttcaatgtgatgtttctgatgaagaagaagttaaatctatgattgaatggactgcttctgcttatggtggtttggatatgatgttttctaatgttggtattatgtccaagtctgctcaaactgttatggatttggatttgttggaatttgataaggttatgagagttaacgctagaggtatggctgcttgtttgaaacatgctgctagaaagatggttgaattgggtactagaggtactattatttgtactactactcctttgtcttctagaggtggtcaatctatgactgattatgctatgtctaagcatgcagttatgggtttggttagatctgcttctattcaattaggtgctcatggtattagagttaactgtgttactccttcagttgttttgactccattggctcaaagaatgggtttggctactccagatgattttcatacacattttggtaacttcactagtttgaaaggtgtttatttgactcctgaacaagttgctgaagctgttgtttatttggcttctgatgatgctgcttttattactggtcatgatttggttttggatggtggtttgttgtgtttgcctttttttgctccttcttaa。
8、在本发明的一些实施方案中，上述基因组合，上述mlpl基因序列如seq id no:4所示：atggcatccaaattggaaattgaaattgaattgaagtccgatgttgaaaagatgtggaagcatttcaaggaatttaccaagttgttcccaaaggcttgtccacatttgtatgaaaagattgatgttattcaaggtgatggtatttccgttggtactattttcgtttccaccttgaagccaactgaattgaatccagttgttatggttaccaaggaaaagattgatttcttggatgatgataacaagatgttgagatactcctacatggaaggtgaaattttgaagaactacaagaacttgagaggtattgttcatatgtcctcctcaaagaacggtggtactattttcaagtactccggtgaatttgaaaaggctaacgaacaagttccagatcctgttttcttcaaggatttcatggttattgttttccaaagattggatgattacgttttgaacggtatgaaccatacctgtcaaaactaa。
9、在本发明的一些实施方案中，上述基因组合，上述zwf1基因序列如seq id no:5所示：atgagtgaaggccccgtcaaattcgaaaaaaataccgtcatatctgtctttggtgcgtcaggtgatctggcaaagaagaagacttttcccgccttatttgggcttttcagagaaggttaccttgatccatctaccaagatcttcggttatgcccggtccaaattgtccatggaggaggacctgaagtcccgtgtcctaccccacttgaaaaaacctcacggtgaagccgatgactctaaggtcgaacagttcttcaagatggtcagctacatttcgggaaattacgacacagatgaaggcttcgacgaattaagaacgcagatcgagaaattcgagaaaagtgccaacgtcgatgtcccacaccgtctcttctatctggccttgccgccaagcgtttttttgacggtggccaagcagatcaagagtcgtgtgtacgcagagaatggcatcacccgtgtaatcgtagagaaacctttcggccacgacctggcctctgccagggagctgcaaaaaaacctggggcccctctttaaagaagaagagttgtacagaattgaccattacttgggtaaagagttggtcaagaatcttttagtcttgaggttcggtaaccagtttttgaatgcctcgtggaatagagacaacattcaaagcgttcagatttcgtttaaagagaggttcggcaccgaaggccgtggcggctatttcgactctataggcataatcagagacgtgatgcagaaccatctgttacaaatcatgactctcttgactatggaaagaccggtgtcttttgacccggaatctattcgtgacgaaaaggttaaggttctaaaggccgtggcccccatcgacacggacgacgtcctcttgggccagtacggtaaatctgaggacgggtctaagcccgcctacgtggatgatgacactgtagacaaggactctaaatgtgtcacttttgcagcaatgactttcaacatcgaaaacgagcgttgggagggcgtccccatcatgatgcgtgccggtaaggctttgaatgagtccaaggtggagatcagactgcagtacaaagcggtcgcatcgggtgtcttcaaagacattccaaataacgaactggtcatcagagtgcagcccgatgccgctgtgtacctaaagtttaatgctaagacccctggtctgtcaaatgctacccaagtcacagatctgaatctaacttacgcaagcaggtaccaagacttttggattccagaggcttacgaggtgttgataagagacgccctactgggtgaccattccaactttgtcagagatgacgaattggatatcagttggggcatattcaccccattactgaagcacatagagcgtccggacggtccaacaccggaaatttacccctacggatcaagaggtccaaagggattgaaggaatatatgcaaaaacacaagtatgttatgcccgaaaagcacccttacgcttggcccgtgactaagccagaagatacgaaggataattag。
10、本发明还提供了表达盒，包括：上述基因组合。
11、本发明还提供了酶组合，包括：isy酶、hgo酶、neps1酶和mlpl酶。
12、在本发明的一些实施方案中，上述表达盒，包括：表达盒1~表达盒4中的一种或多种；
13、所述表达盒1包括：所述crhgo基因和/或所述nmisy基因；
14、所述表达盒2包括：所述neps1基因；
15、所述表达盒3包括：所述mlpl基因；
16、所述表达盒4包括：所述zwf1基因。
17、在本发明的一些实施方案中，上述表达盒，还包括：启动子、终止子和标签中的一种或多种。
18、在本发明的一些实施方案中，上述表达盒中所述启动子包括：gal7和/或gal1,10；
19、所述终止子包括：tgpd1；
20、所述标签包括：ura3基因和/或leu基因。
21、本发明还提供了质粒，包括：上述表达盒。
22、本发明还提供了重组菌株，转化、转染和/或整合上述质粒和/或表达盒。
23、在本发明的一些实施方案中，上述重组菌株中，转化和/或转染的底盘菌株包括：酵母菌、霉菌、细菌和藻类中的一种或多种。
24、在本发明的一些实施方案中，上述重组菌株中，所述酵母菌包括：酿酒酵母菌、解脂属酵母菌和克鲁维属酵母菌中的一种或多种。
25、在本发明的一些实施方案中，上述重组菌株中，所述酿酒酵母菌包括：cen.pk系列和/或by系列。
26、在本发明的一些实施方案中，上述重组菌株中，所述cen.pk系列包括：cen.pk2-1c。
27、在本发明的一些实施方案中，上述重组菌株中，所述霉菌包括：链霉菌。
28、在本发明的一些实施方案中，上述重组菌株中，所述细菌包括：大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌。
29、本发明还提供了上述基因组合、上述表达盒、上述质粒和/或上述重组菌株在生产和/或制备荆芥内酯中的应用。
30、本发明还提供了荆芥内酯的制备方法，将上述重组菌株接种，发酵培养，获得所述荆芥内酯。
31、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述发酵培养包括添加有机相的步骤；所述有机相包括：十四酸异丙酯。
32、在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述十四酸异丙酯的添加量为20%v/v。
33、本发明提供了基因组合，包括：crhgo基因、nmisy基因和neps1基因。
34、本发明通过利用系统工程策略（酶融合表达、调节内源辅因子平衡）和代谢过程优化（染色体整合、两相发酵、营养缺陷标签补齐）的手段，实现荆芥内酯的高效合成，进而获得一株稳定高产荆芥内酯的酿酒酵母菌株。本发明确定了前体底物对整条异源路径的必要性，以及荆芥内酯的异源合成路径对内源代谢产生了辅因子不平衡扰乱，为后续继续优化提产异胡豆苷、长春碱提供有利证据。
1.基因组合，其特征在于，包括：crhgo基因、nmisy基因和neps1基因。
2.如权利要求1所述的基因组合，其特征在于，还包括：mlpl基因和/或zwf1基因。
3.表达盒，其特征在于，包括：如权利要求1或2所述的基因组合。
4.如权利要求3所述的表达盒，其特征在于，包括：表达盒1~表达盒4中的一种或多种；
5.如权利要求3或4所述的表达盒，其特征在于，还包括：启动子、终止子和标签中的一种或多种。
6.如权利要求5所述的表达盒，其特征在于，所述启动子包括：gal7和/或gal1,10；
7.重组菌株，其特征在于，转化、转染和/或整合如权利要求3至6任一项所述的表达盒。
8.如权利要求1或2所述的基因组合、如权利要求3至6任一项所述的表达盒和/或如权利要求7所述的重组菌株在生产和/或制备荆芥内酯中的应用。
9.荆芥内酯的制备方法，其特征在于，将如权利要求7所述的重组菌株接种，发酵培养，获得所述荆芥内酯。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养包括添加有机相的步骤；所述有机相包括：十四酸异丙酯。
