本发明涉及生化工程，具体涉及一种ω-转氨酶及其突变体、载体、工程菌，还涉及ω-转氨酶突变体在合成(r)-n-boc-3-氨基哌啶中的应用。
背景技术：
1、杂环手性胺是手性胺类化合物中的重要组成，是许多生物活性天然产物和药物相关化合物中常见的结构单元。近年，fda批准的超过50％的独特小分子药物含有氮杂环，六元杂环胺中的哌啶类在杂环胺药物中更是占据重要的位置(kohls h,et al.currentopinion in chemical biology,2014,19:180-192；paul ce,et al.organic processresearch&development,2014,18(6):788-792)。其中光学纯的(r)-3-氨基哌啶已用于多种新型2型糖尿病(t2dm)治疗药物的合成，包括linagliptin、alogliptin benzoate以及trelagliptin succinate等在内的多种二肽基肽酶-ⅳ抑制剂类药物(许良葵，等.中南药学，2008,6(1):85–88)。(r)-n-3-氨基哌啶的合成主要通过化学合成法，动力学拆分法，以及新兴的酶法催化合成(ward j,et al.current organic chemistry,2010,14(17):1914–1927)。化学合成法主要有两种：前手性酮的化学不对称还原法以及以手性化合物为原料的合成方法。通过前手性酮进行化学不对称合成的方法最为传统，其产物收率，光学纯度不易控制，对一些复杂结构化合物的合成极为困难(yi s s,et al.process biochemistry,2007,42(5):895–898)。而以包含手性中心的化合物为原料，不仅不需要在反应过程中进行不对称合成以及动力学拆分，产物光学纯度也能得到保证。但这种方法易受到手性原料的成本限制，且反应步骤冗长，收率不高。与化学合成法相比，手性拆分法往往简单快速，但是不同的拆分方法又具有显著的缺陷，例如结晶法拆分条件苛刻，产率不高，利用生物或色谱法拆分则需要高昂的成本。
2、迄今为止，采用化学合成法制备(r)-3-氨基哌啶的应用已不胜枚举，然而通过化学合成与手性拆分法的方法仍存在如产率，光学纯度，成本控制等诸多应用上的不足之处。随着生物学兴起以及绿色生产的需要，近年来用生物转化法制备手性3-氨基哌啶开始受到了人们的关注(xie y,et al.catalysis science&technology,2022,(7):2162–2175)。生物转化法是以手性酮3-哌啶酮或添加n保护基团的3-哌啶酮为原料，通过(r)型转氨酶不对称催化合成(r)-3-氨基哌啶。如范文超等以重组d-转氨酶、杨晟等与robins等使用ω-转氨酶对3-哌啶酮进行了生物转化法制备(r)-3-氨基哌啶(cn104178536；cn103865964；cortim,et al.journal of pharmaceutical&biomedical analysis,2019,169:260–268)。他们的研究中都是使用天然转氨酶，但转化效率并不高，还无法应用于大规模的工业化生产。
3、利用ω-转氨酶生物合成(r)-3-氨基哌啶，应用前景十分广阔。采用半理性设计对天然的ω-转氨酶进行分子改造，提高其的催化性能、对推动生物合成(r)-3-氨基哌啶工业化应用进程具有重要意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种ω-转氨酶；本发明的目的之二在于提供一种编码所述ω-转氨酶的基因；本发明的目的之三在于提供一种ω-转氨酶突变体；本发明的目的之四在于提供一种含有所述ω-转氨酶突变体编码基因的载体；本发明的目的之五在于提供一种含有所述载体的重组基因工程菌；本发明的目的之六在于提供所述ω-转氨酶突变体在生物酶法制备(r)-n-boc-3-氨基哌啶中的应用。
2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、1、一种ω-转氨酶，来自产黄青霉(penicillium chrysogenum)，所述ω-转氨酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、2、一种编码所述ω-转氨酶的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、3、一种ω-转氨酶突变体，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列是由seq id no.2所示ω-转氨酶突变所得，所述突变为v60s、e115y、e115q、t272s、t272g、t273s、t273k、t273a、v60s/e115y/t273s、e115y/t272s/t273a、v60s/e115q/t273s、v60s/e115y/t272s/t273s、v60s/e115y/t272s/t273a或v60s/e115q/t272s/t273k中的任意一种。
6、本发明优选的，编码突变为v60s/e115y/t272s/t273s的ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。
7、本发明优选的，一种编码所述ω-转氨酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
8、4、含有所述ω-转氨酶突变体的编码基因的载体。
9、5、含有所述载体的重组基因工程菌。
10、6、所述ω-转氨酶突变体在生物酶法制备(r)-n-boc-3-氨基哌啶中的应用。
11、本发明优选的，所述应用包含如下步骤：含ω-转氨酶突变体编码基因载体的工程菌经发酵培养，纯化获得重组ω-转氨酶，以重组ω-转氨酶作为生物催化剂，以n-boc-3-哌啶酮为底物，以α-苯乙胺为辅助底物，以5-磷酸吡哆醛为辅酶，以ph8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30℃条件下反应，反应完全后将反应液分离纯化，获得(r)–n-boc-3-氨基哌啶。
12、本发明优选的，所述重组ω-转氨酶的浓度为1.0mg/ml，n-boc-3-哌啶酮的浓度为5mm，α-苯乙胺的浓度为10mm，以ph 7.5.0～9.0的50mm tris-hcl作为反应介质，反应时间为60min。
13、本发明的有益效果在于：本发明公开了一种ω-转氨酶突变体及其在合成(r)-n-boc-3-氨基哌啶的应用，本发明通过对转氨酶编码基因的密码子进行优化，得到了一种核苷酸序列如seq id no.1所示的转氨酶编码基因。在此基础上，通过构建转氨酶的突变体库得到了一系列所述转氨酶突变体，并筛选出最优突变体。本发明所获得的重组转氨酶催化剂能够催化合成(r)-n-boc-3-氨基哌啶，反应转化率可达18.26％，产物光学纯度可达99％以上。且通过蛋白质工程改造获取的转氨酶突变体相比野生型母本活力提高明显，最优突变体相比野生型母本的活性提升4.51倍，反应转化率可达86.65％，且产物ee在99％以上。
1.一种ω-转氨酶，来自产黄青霉(penicillium chrysogenum)，其特征在于，所述ω-转氨酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.一种编码权利要求1所述ω-转氨酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列是由seqid no.2所示ω-转氨酶突变所得，所述突变为v60s、e115y、e115q、t272s、t272g、t273s、t273k、t273a、v60s/e115y/t273s、e115y/t272s/t273a、v60s/e115q/t273s、v60s/e115y/t272s/t273s、v60s/e115y/t272s/t273a或v60s/e115q/t272s/t273k中的任意一种。
4.根据权利要求3所述ω-转氨酶突变体，其特征在于，编码突变为v60s/e115y/t272s/t273s的ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。
5.一种编码权利要求4所述ω-转氨酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
6.含有权利要求3所述ω-转氨酶突变体的编码基因的载体。
7.含有权利要求6所述载体的重组基因工程菌。
8.权利要求3所述ω-转氨酶突变体在生物酶法制备(r)-n-boc-3-氨基哌啶中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包含如下步骤：将含ω-转氨酶突变体的编码基因载体的工程菌发酵培养，纯化获得重组ω-转氨酶，以重组ω-转氨酶作为生物催化剂，以n-boc-3-哌啶酮为底物，以α-苯乙胺为辅助底物，以5-磷酸吡哆醛为辅酶，以ph8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30℃条件下反应，反应完全后将反应液分离纯化，获得(r)–n-boc-3-氨基哌啶。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述重组ω-转氨酶的浓度为1.0mg/ml，n-boc-3-哌啶酮的浓度为5mm，α-苯乙胺的浓度为10mm，以ph 7.5.0～9.0的50mm tris-hcl作为反应介质，反应时间为60min。
