本发明属于生物医药，具体涉及一种arhgap9的小分子抑制剂及在增强细胞抗癌效力中的应用。
背景技术：
1、rho(ras homolog)家族是一类含有gtpase结构域的ras超家族成员，其活性受其gtpase结构域调节，以无活性的rho-gdp和有活性的rho-gtp两种形式相互转换发挥分子开关的作用。rho家族蛋白功能复杂，参与了细胞形态、运动、分裂、基因表达、细胞骨架调控，目前已知与心血管疾病、肿瘤侵袭转移、自身免疫疾病、帕金森等疾病均有关。rho-gaps亚家族是rho-gtp信号的抑制分子，目前已知有47个成员，arhgap9(rhogtp酶激活蛋白9)是rho-gaps亚家族成员之一，然而arhgap9在目前癌症的功能报道中存在矛盾，有部分文章报道arhgap9是促癌基因，包括arhgap9可促进结肠癌细胞增殖和转移(sun et al.tissuecell.2022)；arhgap9在卵巢癌中高表达，与患者预后负相关，可作为卵巢癌的预后指标(shen et al.transl cancer res.2021；10:4440-4453.)。但也有相反报道提示arhgap9是抑癌基因，包括生信分析发现相较arhgap9低表达患者，arhgap9高表达乳腺癌、膀胱癌患者生存期更长，预后更佳(chen et al.oncol lett.2019；18:6017-6025.)；arhgap9抑制了肝癌细胞增殖和迁移(zhang et al.cell death dis.2018；9:916.)；arhgap9敲除可促进肺癌转移(song et al.genomics.2023)。因此arhgap9在癌症发生发展中的作用尚存在争议。目前尚无arhgap9的抑制剂被报道。目前主流的科研只能选择sirna,shrna,crispr/grna技术对arhgap9进行敲降或敲除，但这些方法均存在操作复杂，价格昂贵，重现性不佳等问题，因此开发能有效抑制arhgap9的小分子抑制剂可极大的方便科研用途中的arhgap9抑制实验，为后续的研究助力。
2、另一方面，近年来，以car-t和car-nk为代表的细胞疗法在临床癌症治疗中取得了巨大的成功。在2012年，美国女孩emily在经历过急性淋巴性白血病两次复发后，经car-t治疗后，成为第一个利用car-t疗法治愈的白血病患儿。目前，已经上市临床使用的car-t疗法共9个，其中6款靶向cd19，3款靶向bcma，分别用于b细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗，多款双靶点的car-t细胞产品也在临床试验中，如同时靶向cd19/cd20,cd19/cd22,bcma/cd38，bcma/cs1等(cancers.2023feb 4；15(4):1003.)。car-nk与car-t疗法相似，同样采用基因工程方法将car分子表达在nk细胞上，输入体内进行抗肿瘤治疗，也在临床试验中响应率达到73％，显著延长了患者生存期。目前car-nk疗法被报道相较car-t疗法具有更好的安全性，不会引起致命的细胞因子风暴和神经毒性，无需hla配型可提前制备(n engl jmed.2020feb6；382(6):545-553.)。但目前car-t和car-nk疗法在实体瘤中的效果不佳，主要是由于实体瘤的免疫抑制微环境导致输注的car-t和car-nk浸入实体瘤和在实体瘤微环境中功能受到抑制。已有的临床试验正在开展将趋化因子受体表达在car-t细胞表面，利用实体瘤高表达的趋化因子配体，促进car-t细胞向肿瘤组织的浸润(nct03602157)。针对car-t的活化，已有大量报道证实，联合使用免疫检查点抑制剂pembrolizumab、nivolumab、ipilimumab等通过阻断car-t细胞的pd-1、ctla-4抑制性受体，或采用基因编辑策略敲除car-t细胞中的免疫检查点受体pd1、tigit等，均可有效提升car-t疗法的抗肿瘤作用(molcancer.2022mar 18；21(1):78；front immunol.2023jun 9:14:1175920.)。然而，目前尚未见到将arhgap9的抑制与car-t或car-nk的抗肿瘤效力联系起立的报道。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种体外抑制arhgap9的小分子抑制剂及抑制方法和在提供免疫细胞和免疫工程细胞抗癌效力中的用途，以补充现有技术的不足，具体技术方案如下。
2、一种体外处理提高细胞抗肿瘤活性的方法，所述细胞包括免疫细胞或免疫工程细胞；所述方法包括敲除所述细胞中的arhgap9基因或使用小分子药物培养所述细胞使所述细胞表达的arhgap9蛋白降解；所述小分子药物包括紫铆花素。
3、可以理解的是，本发明所述的“小分子抑制剂”是特指紫铆花素作为arhgap9的小分子抑制剂。
4、进一步，所述免疫细胞包括t细胞或nk细胞；所述免疫工程细胞包括car-t细胞或car-nk细胞。
5、进一步，使用紫铆花素培养所述细胞的操作包括将紫铆花素添加到细胞培养基中；添加比例为每6μm紫铆花素用于处理1×105～1×106个细胞，培养时间为3-60小时。
6、在本发明其中一个实施例中，所述培养基的成分包括rpmi1640，10％ fbs，50μm2-巯基乙醇，1×丙酮酸钠，1×非必需氨基酸，1％青霉素/链霉素，25mm hepes，50u/ml鼠源il2，5ng/ml鼠源il-7和25ng/mlil-15。
7、可以理解的是，上述细胞培养基为常规的细胞培养基，上述细胞培养基的成分仅为示例，而不是限制。其他可以培养t细胞或nk细胞的培养基均可适用。
8、进一步，敲除所述细胞中的arhgap9基因的手段包括采用sirna、shrna或crispr/grna。
9、在本发明的其中一个实施例中，敲除所述细胞中的arhgap9基因的手段为crispr/grna；所涉及的grna的序列如seq id no.2～4所示。
10、另一方面，本发明还提供紫铆花素在制备免疫细胞或免疫工程细胞arhgap9蛋白体外诱导降解剂中的应用。
11、进一步，所述免疫细胞包括t细胞或nk细胞；所述免疫工程细胞包括car-t细胞或car-nk细胞。
12、另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤试剂，所述抗肿瘤试剂包括免疫工程细胞和紫铆花素；所述免疫工程细胞包括car-t细胞或car-nk细胞；所述紫铆花素被配置为所述免疫工程细胞的体外免疫激活剂，用于体外诱导降解所述免疫工程细胞表达的arhgap9蛋白。
13、进一步，所述抗肿瘤试剂中紫铆花素和免疫工程细胞根据单位剂量独立配制，所述紫铆花素和所述免疫工程细胞的配比为每6μm紫铆花素用于处理1×105～1×106个免疫工程细胞。
14、进一步，所述抗肿瘤试剂适用的肿瘤类型包括实体肿瘤和血液瘤。
15、进一步，所述抗肿瘤试剂适用的肿瘤靶点包括cd19、bcma、cd20、cd22、egfrviii、cd123、cd33、her2、cd38、cd70、psma、b7-h3、gpc3、gcc、claudin18.2、cea、cd5、epcam、gd2和/或mesothelin等。
16、可以理解的是，上述靶点为常见的实体肿瘤或血液瘤靶点，而本发明实施例实验证明了经过紫铆花素处理的免疫细胞和免疫工程细胞对多种实体肿瘤和血液瘤有效。
17、有益技术效果
18、本发明提供了一种通过敲除免疫细胞或免疫工程细胞arhgap9基因或使免疫细胞或免疫工程细胞表达出的arhgap9蛋白体外诱导降解的手段可提高免疫细胞或免疫工程细胞抗癌效力的方法。
19、本发明在前期实验中，经过大量筛选，发现小分子抑制剂紫铆花素可以在体外有效诱导降解car-t细胞或car-nk细胞的arhgap9蛋白，进而显著提高了car-t细胞或car-nk细胞在多种癌细胞中的抗癌效力。实验发现，仅需要低浓度的紫铆花素就可以实现上述技术目的，极大地避免了传统使用sirna、shrna、crispr/grna技术对t和nk细胞的arhgap9进行敲降或敲除存在的操作复杂、价格昂贵、敲除效率低下、重现性差等问题，具有更广阔的临床应用前景。
20、综上，本发明提出，紫铆花素可作为arhgap9的新型小分子抑制剂，具有科研和临床的双重用途。科研方面，可便捷地使用紫铆花素抑制arhgap9激活nk细胞和cd8+t细胞，用于nk和cd8+t细胞激活实验研究。临床用途方面，可通过紫铆花素预处理car-t和car-nk细胞后再进行输注，或输注car-t和car-nk细胞后，给予紫铆花素治疗，提高car-t和car-nk的抗肿瘤作用。
1.一种体外处理提高细胞抗肿瘤活性的方法，其特征在于，所述细胞包括免疫细胞或免疫工程细胞；所述方法包括敲除所述细胞中的arhgap9基因或使用小分子药物培养所述细胞使所述细胞表达的arhgap9蛋白降解；所述小分子药物包括紫铆花素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞包括t细胞或nk细胞；所述免疫工程细胞包括car-t细胞或car-nk细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用紫铆花素培养所述细胞的操作包括将紫铆花素添加到细胞培养基中；添加比例为每6μm紫铆花素用于处理1×105～1×106个细胞，培养时间为3-60小时。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，敲除所述细胞中的arhgap9基因的手段包括采用sirna、shrna或crispr/grna。
5.紫铆花素在制备免疫细胞或免疫工程细胞arhgap9蛋白体外诱导降解剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括t细胞或nk细胞；所述免疫工程细胞包括car-t细胞或car-nk细胞。
7.一种抗肿瘤试剂，其特征在于，所述抗肿瘤试剂包括免疫工程细胞和紫铆花素；所述免疫工程细胞包括car-t细胞或car-nk细胞；所述紫铆花素被配置为所述免疫工程细胞的体外免疫激活剂，用于体外诱导降解所述免疫工程细胞表达的arhgap9蛋白。
8.如权利要求7所述的抗肿瘤试剂，其特征在于，所述抗肿瘤试剂中紫铆花素和免疫工程细胞根据单位剂量独立配制，所述紫铆花素和所述免疫工程细胞的配比为每6μm紫铆花素用于处理1×105～1×106个免疫工程细胞。
9.如权利要求7所述的抗肿瘤试剂，其特征在于，所述抗肿瘤试剂适用的肿瘤类型包括实体肿瘤和血液瘤。
10.如权利要求7所述的抗肿瘤试剂，所述抗肿瘤试剂适用的肿瘤靶点包括cd19、bcma、cd20、cd22、egfrviii、cd123、cd33、her2、cd38、cd70、psma、b7-h3、gpc3、gcc、claudin18.2、cea、cd5、epcam、gd2和/或mesothelin。
