本发明属于电化学发光领域，具体涉及一种bcno为共反应促进剂，ptc-pei为发光体的用于检测毒死蜱的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用。
背景技术：
1、毒死蜱(cpf)作为一种广谱含氯有机磷试剂，因其对害虫的良好消杀作用被广泛使用在农业生产中。然而，毒死蜱的化学性质非常稳定，难以在生态系统中快速的降解。即使在低剂量下，cpf也能通过抑制人体内乙酰胆碱酶的活性使神经系统长期处于兴奋状态，从而影响正常的神经传导，最终造成人体内分泌失调、生长发育异常以及中枢神经异常等疾病。因此准确的测定农作物以及环境中cpf的含量对保护人体健康有重要意义。到目前为止已经开发了一系列用于检测毒死蜱的方法，比如酶联免疫吸附法、比色法、高效液相色谱法。以上几种检测方案虽然能够对cpf进行高灵敏度检测，但他们存在耗时、昂贵、操作困难等缺点。因此有必要开发一种便捷、准确的方法，用于cpf的痕量分析。
2、电化学发光(ecl)技术结合了光谱学和电化学的优点，具有低背景信号、高灵敏度和宽检测范围的优势，被广泛应用于试剂样品的检测。ecl传感器在通过信号扩增策略提高检测灵敏度方面显示出了巨大的潜力，发展出许多信号扩增的方法，如通过dna扩增技术实现信号增长以及利用纳米材料的催化作用实现信号扩增等。这些方法为毒死蜱的检测提供了新的思路和手段，有望解决现有检测方法的不足，提供更加高效和便捷的检测方案。
技术实现思路
1、本发明针对检测毒死蜱现有灵敏度技术的不足，提供了一种电化学发光传感器检测的方法。本发明基于bcno与ptc-pei之间存在的催化作用，以ptc-pei作为发光体，bcno作为催化剂提高ptc-pei的ecl性能。先将bcno修饰在电极表面，之后通过静电吸附作用将split-1与bcno相连，随后再将split-2/ptc-pei滴涂在该电极表面，制得电化学发光传感器。当检测物毒死蜱与传感器接触后，促使发光体ptc-pei负载到电极表面并形成夹心型结构，引起电化学发光的信号增强(图2)。基于检测物毒死蜱的浓度与电化学发光增长的强度不同，实现对毒死蜱的检测。由于检测物毒死蜱与分裂适配体具有更好的特异性结合，该传感器具有很好的选择性。
2、本发明采用的方案如下：
3、本发明首先提供了一种基于电化学发光法检测毒死蜱的适配体传感器，由split-2/ptc-pei/split-1/bcno修饰在玻碳电极表面，并将其作为电化学发光检测的工作电极；其中，split-1和split-2为毒死蜱分裂适配体，split-1的核苷酸序列为5′-cctgccacgctccgcaagcttagggttacgcctg-3′；split-2的核苷酸序列为5′-tgatcgcgctgctggtaatccttctttaagcttgg-3′。
4、本发明还提供了上述基于电化学发光法检测毒死蜱的适配体传感器的制备方法，将split-2/ptc-pei/split-1/bcno/gce作为工作电极， ag/agcl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，组成三电极体系，具体步骤如下：
5、(1)bcno材料的制备方法：
6、将硼酸、尿素、peg 20k在水中混合，将混合物置于60 °c的烘箱中烘干得到白色混合物；将混合物在750 °c下的马弗炉中以5 °c/min的升温速率煅烧1 ~2 h，得到黄色的块状bcno，冷却后将bcno研磨成粉末并溶于dmf中，转移到聚四氟乙烯反应釜中，于110 °c烘箱中加热10 ~12 h，得到bcno。
7、(2)split-2/ptc-pei的制备方法：
8、将苝-3,4,9,10-四羧酸二酐溶于0.05~0.1 m的naoh水溶液中，随后加入0.1 m的hcl水溶液至沉淀析出，离心干燥得到前驱体ptca。随后1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺(edc)与n-羟基丁二酰亚胺(nhs)按质量比为4：1加入ptca的水溶液中并在冰浴下搅拌5~6 h。之后在上述溶液中再加入4~6 ml的聚醚酰亚胺(pei)搅拌11~13 h，离心干燥得到暗红色的ptc-pei。
9、将ptc-pei于split-2摇床孵育7~8 h，即可得到split-2/ptc-pei。
10、(3) split-2/ptc-pei/split-1/bcno/gce的制备
11、用0.3 μm的氧化铝抛光粉将玻碳电极表面（玻碳电极内芯为3 mm）打磨干净后用乙醇和超纯水进行超声，清洗掉残留在电极表面的抛光粉后将处理好的电极在白炽灯下照干备用。取3~5 μl bcno滴涂在处理好的电极表面后用白炽灯照干，再将3~5 μl 1~5 μm的split-1在电极表面孵育6~10 h，split-1的核苷酸序列为： 5′-cctgccacgctccgcaagcttagggttacgcctg-3′，随后将3~5 μl split-2/ptc-pei滴涂在电极表面，得到split-2/ptc-pei/split-1/bcno/gce，split-2的核苷酸序列为5′-tgatcgcgctgctggtaatccttctttaagcttgg-3′。
12、其中，bcno与ptc-pei的质量比为1~5:3；优选3~5:3；最优选4:3。
13、将bcno配置成1 mg/ml的分散液，修饰量为3~5 μl；split-1和split-2的浓度均为1~5 μm ，split-2的修饰量为3~5 μl。使用1~5 μm的split-2将ptc-pei配置成1 mg/ml的分散液，split-2/ptc-pei修饰量为3~5 μl。
14、本发明进一步提供了上述基于电化学发光法检测毒死蜱的适配体传感器在电化学发光检测毒死蜱中的应用。具体检测方法如下：
15、s1含k2s2o8的pbs缓冲溶液的配制
16、用ph=7.4的pbs（0.1 mol/l）配置成含0.05 mol/l k2s2o8的缓冲溶液。
17、s2不同浓度的毒死蜱标准溶液的配置
18、使用步骤(1)的溶液，将浓度为0.1mg/ml的毒死蜱溶液配稀释成一系列不同浓度的毒死蜱标准溶液。浓度范围为：为1.0×10-7 g/l～1.0×10-14 g/l。
19、s3标准曲线的绘制
20、将split-2/ptc-pei/ split-1/bcno/gce作为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，将4~6 μl不同浓度毒死蜱（1.0×10-14 g/l～1.0×10-7 g/l）滴加在电极表面进行特异性识别，以步骤s1中的pbs缓冲溶液作为电解液，在-1.5～0 v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压750v，放大级数为3，扫速0.15 v/s，进行循环伏安扫描，记录标准溶液浓度的对数值（log c）与加入毒死蜱前后的发光强度差值（δecl），即可得到检测毒死蜱的线性回归方程。
21、s4实际样品检测：取含有毒死蜱的试剂样品4~6 μl，滴加在所构建的ecl适配体传感器split-2/ptc-pei/ split-1/bcno/gce上，以其作为工作电极，再采用步骤(6)方法检测发光强度。从步骤s3所对应线性回归方程曲线上，根据加入试样前后发光强度的差值（δecl）即可得出实际样品中毒死蜱的浓度。
22、与现有的技术相比，本发明的有益效果为：
23、本发明涉及了一种基于bcno催化ptc-pei的电化学发光传感器。bcno作为一种共反应促进剂，bcno的b·自由基能够促进大量s2o82-分解为so4·-，促进发光体ptc-pei的ecl信号增强，催化ptc-pei产生高效而稳定的电化学发光性能。通过分裂适配体对毒死蜱的特异性结合，形成稳定的三元夹心结构，以实现对毒死蜱的灵敏检测。本发明的检测范围为1.0×10-14～1.0×10-7 mg/ml，最低检测限为9.12×10-15 mg/ml。该适配体传感器在毒死蜱的检测中表现出了非常好的性能，也为内分泌干扰物的检测提供了新的方法。
1.一种基于电化学发光法检测毒死蜱的适配体传感器，其特征在于：所述传感器由split-2/ptc-pei/split-1/bcno修饰在玻碳电极表面，并将其作为电化学发光检测的工作电极；其中，split-1和split-2为毒死蜱分裂适配体，split-1的核苷酸序列为5′-cctgccacgctccgcaagcttagggttacgcctg-3′；split-2的核苷酸序列为5′-tgatcgcgctgctggtaatccttctttaagcttgg-3′。
2.权利要求1所述的基于电化学发光法检测毒死蜱的适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的基于电化学发光法检测毒死蜱的适配体传感器的制备方法，其特征在于，bcno与ptc-pei的质量比为1~5:3。
4.根据权利要求2所述的基于电化学发光法检测毒死蜱的适配体传感器的制备方法，其特征在于，bcno材料的制备方法为：将硼酸、尿素、peg 20k在水中混合，浓缩干燥后将白色混合物在750 °c下煅烧1 ~2 h，冷却后研磨成粉，随后将粉末溶于dmf中在反应釜中110°c加热10 ~12 h，离心干燥，得到bcno。
5.根据权利要求2所述的基于电化学发光法检测毒死蜱的适配体传感器的制备方法，其特征在于，ptc-pei的制备方法为：将苝-3,4,9,10-四羧酸二酐溶于0.05~0.1 mol/l的naoh水溶液中，随后加入0.1 mol/l的hcl水溶液至沉淀析出，离心干燥得到前驱体ptca；随后1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺与n-羟基丁二酰亚胺按质量比为4：1加入ptca的水溶液中并在冰浴下搅拌5~6 h；再加入4~6 ml的聚醚酰亚胺，搅拌11~13 h，离心干燥得到ptc-pei。
6.根据权利要求2所述的基于电化学发光法检测毒死蜱的适配体传感器的制备方法，其特征在于，bcno分散液的浓度为1mg/ml；split-2/ptc-pei溶液中ptc-pei的浓度为1mg/ml；split-1溶液的浓度为1~5μmol/l；split-2溶液的浓度为1~5μmol/l。
7.权利要求1所述的基于电化学发光法检测毒死蜱的适配体传感器在电化学发光检测毒死蜱中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测步骤为：
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：循环伏安扫描的条件为：在-1.5 ~0 v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压750 v，放大级数为3，扫速0.15 v/s。
