本发明属于生物酶合成，具体地说，是关于一种udp-glcntfa的制备方法。
背景技术：
1、糖基化修饰是一种普遍的生物化学现象，它在生物界的大分子和小分子中均有发现。如蛋白质通过糖基化修饰以增强其稳定性，也存在于生物小分子中，如植物天然产物的糖基化修饰以改善其溶解性及生物利用度。糖基化过程涉及到多种糖供体，例如udp-糖类、gdp-糖类和tdp-糖类。其中，udp-糖类是最常用的糖供体，可在udp-糖基转移酶的作用下与受体分子的羟基、羧基、氨基或巯基等官能团发生反应，形成具有更佳溶解性和生理活性的糖苷化合物。
2、udp-glcntfa是一种重要的糖核苷酸衍生物，在生物体内的多种生物学活动中发挥着至关重要的作用。它不仅在糖基化过程中起到催化作用，还在细胞间的信号传递中扮演着关键角色。作为多种糖蛋白和糖脂的组成部分，udp-glcntfa不仅具有显著的生物学意义，也因其在医药和生物技术领域的应用潜力而备受重视。
3、目前，udp-glcntfa的制备主要依赖于化学合成方法，但该方法存在步骤繁琐、产率低、成本高等缺点，难以满足大规模制备的需求(市场售价约15000人民币/1mg)。文献(xiaoyan li,et al.efficient chemoenzymatic synthesis of uridine 5′-diphosphate n-acetyl glucosamine and uridine 5′-diphosphate n-trifluoacetylglucosamine with three recombinant enzymes,preparative biochemistry andbiotechnology,2017,vol(47):9852-859)报道使用生物酶法合成udp-glcntfa，但该文献中使用的方法，所涉及的酶来源不同，得到的udp-glcntfa纯度较低，且没有公开具体的纯化方法，显然难以在工业上大量生产。因此，开发一种经济的udp-glcntfa制备方法具有重要的意义。
技术实现思路
1、有鉴于现有技术所存在的上述需求，本发明致力于开发一种更经济的udp-glcntfa的制备方法，以适应大规模工业生产，并降低成本。
2、为实现上述目的，本发明的第一个方面，提供了一种udp-glcntfa的制备方法，所述方法是以n-三氟乙酰葡萄糖胺为底物，以同时产n-乙酰葡萄糖胺激酶(nahk)、n-三氟乙酰葡萄糖胺-1-p酶(glmu)和无机焦磷酸酶(ppase)三种酶的大肠杆菌基因工程菌的菌泥为催化剂，酶法合成udp-glcntfa。
3、根据本发明，所述酶法合成udp-glcntfa的反应体系包括tris-hcl缓冲盐、atp、utp、mg2+、同时产nahk、glmu和ppase三种酶的大肠杆菌基因工程菌的菌泥、以及十六烷基三甲基溴化铵(ctab)。
4、根据本发明的优选实施例，50ml的所述反应体系如下：
5、
6、根据本发明的优选实施例，所述酶法合成udp-glcntfa的反应温度为37℃。
7、根据本发明，所述同时产nahk、glmu和ppase三种酶的大肠杆菌基因工程菌通过以编码nahk、glmu和ppase三种酶的基因根据宿主菌的偏好性进行密码子优化后，构建重组表达质粒，并转入同一株大肠杆菌宿主菌而得到。
8、优选的，所述编码nahk酶的基因的优化序列如seq id no.1所示；所述编码glmu酶的基因的优化序列如seq id no.2所示；所述编码ppase酶的基因的优化序列如seq idno.3所示。
9、根据本发明的优选实施例，所述大肠杆菌宿主菌为escherichia coli.bl21(de3)。
10、根据本发明的优选实施例，所述方法还包括纯化的步骤：反应后的样品上c18柱，使用体积比95:5的磷酸盐缓冲液-甲醇为流动相，进行等度洗脱，收集各洗脱组分，选取udp-glcntfa纯度较高的组分，合并后进行冷冻干燥。
11、更优选的，所述还包括除盐的步骤：将冷冻干燥的样品使用合适的有机溶剂溶洗，以除去反应体系中的盐。优选的，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈。
12、本发明的第二个方面，提供了一种用于上述方法的大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌转化了编码nahk、glmu和ppase三种酶的基因的优化序列的重组表达质粒。
13、本发明具有以下有益效果：
14、1、本发明通过分别下载编码nahk、glmu和ppase三种酶的基因序列，根据宿主菌的密码子偏好对其催化结构域的部分序列进行密码子优化，构建了相应的重组表达质粒，经分次转化同一株大肠杆菌宿主菌，成功获得了能够同时产nahk、glmu和ppase这三种酶的基因工程菌，使用该工程菌的发酵菌泥即可一锅法酶法合成udp-glcntfa，从而大大简化了生产工艺，有望实现大规模工业应用。
15、2、本发明成功实现了以n-三氟乙酰葡萄糖胺(glcntfa)为底物，在同时产nahk、glmu和ppase三种酶的基因工程菌的菌泥的催化下，一锅法高效合成udp-glcntfa，经过适当的纯化和除盐步骤，能够得到高纯度的udp-glcntfa，为udp-glcntfa的制备提供了一条新的途径。
1.一种udp-glcntfa的制备方法，其特征在于，所述方法是以n-三氟乙酰葡萄糖胺为底物，以同时产nahk、glmu和ppase三种酶的大肠杆菌基因工程菌的菌泥为催化剂，酶法合成udp-glcntfa。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶法合成udp-glcntfa的反应体系包括tris-hcl缓冲盐、atp、utp、mg2+、同时产nahk、glmu和ppase三种酶的大肠杆菌基因工程菌的菌泥、以及十六烷基三甲基溴化铵。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，50ml的所述反应体系如下：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同时产nahk、glmu和ppase三种酶的大肠杆菌基因工程菌通过以编码nahk、glmu和ppase三种酶的基因根据宿主菌的偏好性进行密码子优化后，构建重组表达质粒，并转入同一株大肠杆菌宿主菌而得到。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述编码nahk酶的基因的优化序列如seqid no.1所示；所述编码glmu酶的基因的优化序列如seq id no.2所示；所述编码ppase酶的基因的优化序列如seq id no.3所示。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌宿主菌为escherichiacoli.bl21(de3)。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括纯化的步骤：反应后的样品上c18柱，使用体积比95:5的磷酸盐缓冲液-甲醇为流动相，进行等度洗脱，收集各洗脱组分，选取udp-glcntfa纯度较高的组分，合并后进行冷冻干燥。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括除盐的步骤：将冷冻干燥的样品使用合适的有机溶剂溶洗，以除去反应体系中的盐。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈。
10.一种用于权利要求1～9中任一项所述的方法的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌分别转化了编码nahk、glmu和ppase三种酶的基因的优化序列的重组表达质粒。
